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11个水稻冷响应相关基因的筛选与突变体鉴定

靳宏沛  
【摘要】:水稻是重要的单子叶模式作物,也是我国主要的粮食作物之一。水稻在生长发育中,低温冷害是常见的问题。研究水稻耐冷性的分子生理机制对我国水稻高产高效生产和粮食安全具有重要意义。为了研究低温在水稻中的作用机制,最直接有效的工具就是构建水稻突变体,基因敲除是实现该目标的最有效方法。本研究从水稻低温表达芯片中挑选了11个受低温胁迫诱导表达的基因,利用CRISPR/Cas9技术创制了8个基因的功能缺失突变体,以及3个购自RISD(Rice T-DNA Insertion Sequence Database)的T-DNA突变体,研究这些基因与耐冷性的关系,主要结果如下:1.水稻低温响应基因的筛选:根据日本晴幼苗低温芯片基因表达谱筛选出11个低温响应基因(Metall、UL、WRKY45、WI12、ADT、RBP、OS2、POT、PRP、CP12和RCI2-6)。qRT-PCR检测了这11个基因在4℃条件下诱导表达水平,发现PRP基因的表达受诱导最为显著;WRKY45和WI12基因在4℃诱导表达也明显;ADT、RBP、OS2和POT基因受低温诱导水平较低;而Metall、UL、CP12和RCI2-6基因在4℃低温条件下有一定变化。初步说明这些基因与低温有一定的关系。2.CRISPR/Cas9缺失突变体的创建:利用CRISPR/Cas9技术构建了WI12、ADT、RBP、OS2、POT和PRP基因的CRISPR/Cas9双靶位点载体。另外,CP12和RCI2-6基因各选取一个靶位点,构建了这两个基因的共同双靶位点载体。利用农杆菌遗传转化法获得了52株基因编辑突变体。其中,WI12、RBP、OS2、POT和PRP基因转基因株系已筛选到纯合突变体,ADT基因已筛选到杂合突变体,而CP12和RCI2-6基因已筛选到杂合双突变体。其中,POT基因转基因株系P-56,编辑比较特殊,发生了不在靶位点(在两个靶位点之外)编辑的大片段缺失。3.Metall、UL和WRKY45蛋白的亚细胞定位:构建了3个基因(Metall、UL和WRKY45)的亚细胞定位表达载体,分别转化到水稻原生质体。激光共聚焦显微镜观察发现,Metall定位在细胞质中,UL定位在叶绿体中,WRKY45定位在细胞核中。4.Metall、UL和WRKY45基因T-DNA纯合突变体株系农艺性状调查:共分离检测筛选获得了3个T-DNA纯合突变体,qRT-PCR检测T-DNA纯合突变体目的基因表达均比野生型低。Metall、UL和WRKY45 T-DNA纯合突变体株系的结实率、穗长、1-4级节间长度、株高和有效分蘖数等指标均比野生型DJ显著下降,说明这3个基因缺失影响了水稻的生长发育。5.T-DNA纯合突变体耐冷性鉴定:水稻纯合突变体和野生型株系的三叶期幼苗4℃胁迫处理。Metall纯合突变体4℃处理4d,UL和WRKY45纯合突变体4℃处理5d,恢复生长后发现Metall、UL和WRKY45基因的T-DNA突变体株系均对低温比较敏感,这3个基因可能正调控水稻的耐冷性。


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