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基于寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶活性的抗病毒抑制剂筛选

苗娟  
【摘要】:寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,主要通过蚊虫媒介传播。该病毒可以穿过血脑屏障,进而引发一些神经并发症和先天性寨卡病毒综合症,并造成不可逆的神经损害。随着该病毒在全球范围内迅速蔓延,已引起国际卫生组织的高度重视,然目前市场上却没有针对寨卡病毒的特异性药物,因此寻求抗寨卡病毒药物迫在眉睫。ZIKV NS3蛋白酶主要功能是将病毒形成的多聚蛋白切割为独立的功能蛋白,是病毒复制所必需的,因此是一种潜在的抗病毒药物靶标。本研究开展了基于ZIKV NS2B-NS3蛋白酶活性的抗病毒抑制剂筛选。通过荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)方法在体外检测了该蛋白酶的活性,并由此建立了高通量筛选的方法。对本实验室保存的化合物进行筛选,在复筛中获得一些对该蛋白酶具有较好抑制作用的化合物,挑选出一种具有相对较好抑制作用的化合物在细胞水平和动物活体水平上进行了抗病毒作用的研究。具体实验结果如下:1.ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的可溶性表达及化合物库的高通量筛选本研究对表达载体、感受态菌株和诱导温度、时间进行了摸索,最终得到最优的可溶性表达条件,并通过镍柱亲和层析方法纯化得到了大量可溶性的ZIKVNS2B-NS3蛋白酶。然后运用FRET方法检测了ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的活性,并计算求得S/B=13.60和Z′=0.51,该值均符合高通量筛选要求,就对实验室保存的四千多种小分子化合物库进行了筛选。通过初筛和复筛,剔除本身带荧光的假阳性化合物和加样误差造成的假阳性化合物,最终得到抑制率大于80%的十种小分子抑制剂。并将以上十种化合物在DENV、JEV和WNV NS3蛋白酶上进行体外酶活抑制试验,由试验可知,其中对DENV和JEV蛋白酶均有较好抑制作用的有八种化合物,而对WNV蛋白酶较好抑制作用的仅有三种。在此试验基础上我们挑选一种化合物CS-004/04003052进行更深一步的研究。得到以下结果:2.化合物CS-004/04003052的酶动力学研究及其对ZIKV蛋白酶抑制作用的特异性将化合物进行不同浓度的稀释并在不同底物浓度下测蛋白酶的反应速率,作反应速率-底物浓度双倒数曲线,根据米氏方程可知该化合物的抑制常数K_i值为0.1346±0.0243μM/L,且依据各直线相较于X轴,表明该化合物与底物之间是竞争性抑制作用。通过Microscale thermophoresis Test(MST)试验分析数据测定了化合物的酶结合常数K_d值为12.262±5.549μM。其次我们将化合物CS-004/04003052分别在ZIKV、DENV、JEV NS3蛋白酶和PEDV NSP5蛋白酶上进行体外酶活性抑制实验,结果发现该化合物CS-004/04003052只对ZIKV NS3蛋白酶表现出高度特异性抑制作用。3.细胞水平抗病毒作用检测将化合物CS-004/04003052倍比稀释成200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.59μM八个浓度分别加入Vero、BHK-21、Hela细胞,待48h后,加入Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂,然后加入等体积的检测试剂,读取并保存数据、分析数据,并计算CC50,结合测得的IC50可知,该化合物在较高浓度下仍对三种细胞的毒性甚小。通过分析空斑试验结果表明该化合物可抑制寨卡病毒的滴度;间接免疫荧光试验和Western blot试验结果均表明该化合物能抑制寨卡病毒的蛋白表达。同时我们也在细胞水平上探究了该化合物对乙脑病毒的复制是否存在抑制作用,结合空斑试验和Western blot试验结果均表明在细胞水平上该化合物对乙脑病毒的复制无抑制作用。4.动物水平抗病毒作用将化合物CS-004/04003052通过尾静脉注射AG129小鼠,进行抗寨卡病毒体内作用研究。试验结果表明,病毒组该化合物能延缓感小鼠染寨卡病毒的死亡时间。且通过HE切片染色结果分析可知在脑、睾丸、卵巢和脾组织内,给药组内的病理症状与病毒组相比明显得以改善;同时根据荧光定量PCR和空斑试验结果均表明在以上组织内药物组体内病毒的含量显著低于对照组。综合分析可知化合物CS-004/04003052在动物活体水平上对寨卡病毒具有抑制作用。


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