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棉花响应烟粉虱胁迫的分子机制及棉花体细胞胚胎表观基因组学研究

李健英  
【摘要】:棉花作为全球三大转基因作物之一,其纤维品质和产量受到农业害虫的影响。随着转Bt基因棉花推广,鳞翅目害虫棉铃虫、红铃虫得到控制,但其抗性逐渐丧失。烟粉虱(Bemisia tabaci)等刺吸式口器害虫对全球棉花生产造成了巨大的危害,但关于棉花如何感知和防御烟粉虱的信息是非常有限的。本研究以棉花与烟粉虱互作为模型,利用RNA-Seq和sRNA-Seq数据挖掘棉花内源的抗虫机制,构建棉花响应烟粉虱非编码RNA共表达调控网络。在全基因组水平上,利用全基因关联分析(GWAS)挖掘棉花抗性位点。为了更好地进行棉花遗传转化,拓展棉花遗传转化的受体范围,我们建立了连续再生驯化体系,获得了高转化效率棉花受体材料-Jin668,同时系统解析棉花再生和体细胞胚胎发生表观遗传调控机制。因此本研究分两大部分内容,分别探讨棉花内源的抗虫基因鉴定和功能分析以及棉花再生DNA甲基化图谱。主要结果如下:1.棉花-烟粉虱互作转录组分析利用RNA-Seq比较了烟粉虱强抗性品种(HR)和敏感性品种(ZS)在不同侵染时间点转录组差异。功能富集分析表明棉花对烟粉虱侵染的转录反应涉及编码蛋白激酶、转录因子、代谢物合成和植物激素信号的基因。结合GO和KEGG富集分析,HR和ZS感染烟粉虱后抗性基因的转录水平不同。RNA-Seq数据集构建的加权基因共表达网络显示WRKY40和铜转运蛋白是棉花响应烟粉虱侵染的枢纽基因。通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)研究GhMPK3,抑制了MPK-WRKY-JA通路,增强烟粉虱的易感性。本研究为棉花防御烟粉虱响应提供了全面见解,并鉴定了几类控制韧皮部害虫的候选基因。2.棉花响应烟粉虱非编码RNA分子机制解析本研究我们构建了抗性材料(HR)和易感材料(ZS)在烟粉虱侵染下小RNA和降解组测序。总共鉴定出260个miRNA家族和241个靶标。定量PCR分析显示几种miRNA及其相应的靶标呈现出动态的时空表达模式。在RNA-Seq数据集鉴定了2,365个基因间区长链非编码RNA(lincRNAs)。进一步分析发现29个lincRNA转录本中产生17个miRNA前体。全基因组分析鉴定出85个同相位干扰小RNA(phasiRNA)位点,9个PHAS基因由6个miRNA触发,包括编码富含亮氨酸重复序列(LRR)的抗病蛋白,生长素响应因子(ARF)和MYB转录因子。通过构建模型和实验数据,我们探索和扩展了miR390-tasiARF在棉花响应烟粉虱侵染转录调控机制。VIGS沉默ARF8增加了生长素和茉莉酸,导致对烟粉虱侵染耐受性增加。通过对不同的非编码RNA进行综合分析,为植虫互作提供了有用的转录组数据资源。3.关联分析挖掘棉花抗虫位点本研究收集了269份陆地棉材料组成的自然群体,鉴定了2.88百万SNPs并进行群体进化树,群体结构,PCA分析和连锁不平衡分析。269份棉花材料在三个环境中进行棉花四个抗虫指数调查,叶片危害率(LDR),整体植株危害率(PDR),感抗等级(SRL)以及盲蝽蟓指数(MI)。我们在三个环境下鉴定了7个LDR,PDR和SRL显著候选位点,其中有一个位点共定位。结合LD分析,整合转录组数据,筛选了一个铜转运子CRC1候选基因。4.多组学数据揭示棉花再生和体细胞胚发育表观基因组学基础本研究通过连续再生驯化(SRA)策略,从母体自交系Y668中选育出具有高再生能力的优质棉花Jin668。我们构建了体细胞胚胎发育过程中的非胚性愈伤组织(NEC),胚性愈伤组织(EC),体细胞胚(SE)以及再生后代植株的叶片全基因组单碱基分辨率甲基化图谱。结果表明,Jin668显示出低DNA甲基化,再生后代中整体甲基化呈下降趋势。在NEC到EC中DNA甲基化上升由RNA介导的DNA甲基化(RdDM)和H3K9me2途径协同调控。在EC到SE中DNA甲基化下降,24-nt siRNA和H3K9me2丰度不变,进一步分析发现DNA去甲基化酶ROS1和DME显著上调,该过程可能依赖于DNA去甲基化途径。整合RNA-Seq和差异甲基化区域(DMR),体细胞胚胎发生过程中低CHH-DMR激活了生长素和WUSCHEL相关基因表达。在NEC中添加DNA甲基化抑制剂增加了胚胎的数量。我们多组学数据为植物组织培养和再生后代植物中DNA甲基化的动态提供了新的见解。该研究还表明诱导的低甲基化可以更好的促进植物再生能力并优化母本遗传栽培品种。


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