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中国梨炭疽病病原种类多样性及果生刺盘孢与梨寄主的互作研究

傅敏  
【摘要】:我国是世界梨的生产大国,其种植面积和产量均居世界首位。然而,近些年来炭疽病在我国主要梨产区的发生和危害明显加重,造成砀山酥梨等主栽品种大量果实腐烂和南方砂梨早期落叶,对梨产业的发展构成新的严重威胁。本研究通过对我国不同梨产区、不同梨种和品种进行炭疽病发生危害系统调查、病原菌分离与种类鉴定和多样性分析,并对所获得的病原菌中引起不同症状的果生刺盘孢(Colletotrichum fructicola)及其侵染后的梨叶片进行转录组分析,旨在明确我国梨产区引起炭疽病的病原菌种类组成、分布范围和危害特点,来源于不同地域和梨种的病原菌的形态学多样性、基因多样性和致病多样性,以及从转录水平阐述C.fructicola在不同侵染阶段的致病机制及寄主梨叶片的防御策略,为深入了解刺盘孢属真菌的形态学特征、分子生物学特性和系统分类提供新的有价值的信息,为我国梨炭疽病的诊断与防治提供理论依据,并为系统研究炭疽病菌的致病机制和植物抗病机理奠定技术基础。取得的主要研究结果如下:1.梨炭疽病的病原菌种类鉴定及其遗传多样性分析。2014年至2016年从我国7个省的主要梨产区采集表现炭疽病症状的样品,通过组织分离法和单孢分离法共获得488个刺盘孢菌株。根据初步的形态学观察及ITS序列分析,并结合其田间症状表现及来源的地区与梨种的不同,选取其中的90个作为代表菌株进行多基因(ACT、TUB2、CAL、CHS-1、GAPDH和ITS)系统发育学和形态学分析,结果显示这些菌株分别归属于刺盘孢属的12个种,其中Colletotrichum aenigma、C.fioriniae、C.fructicola和C.gloeosporioides 4个为已知种,C.citricola、C.conoides、C.karstii、C.plurivorum、C.siamense和C.wuxiense 6个为新寄主种,C.jinshuiense和C.pyrifoliae2个为新报道种。田间症状系统观察显示,我国梨产区炭疽病的症状表现大致可分为5种不同的类型,包括果实苦腐和黑点,叶片凹陷坏死斑、灰白斑和黑点。研究发现,在不同地区和不同梨种上引起炭疽病的病原种类组成有异,砂梨和白梨上C.fructicola为优势种,其在除山东以外的所有调查省份均有分布;西洋梨上C.siamense为优势种,主要分布于山东。从以上的12种炭疽病菌中,选取13个代表菌株以离体‘翠冠’梨叶片和‘黄冠’梨果实为接种材料进行致病性实验,结果显示有伤接种均能致病,而无伤接种多数菌株发病较晚或不发病,表明刺盘孢属真菌多数为弱寄生菌并存在典型的潜伏侵染特性,且不同种的潜伏期有异。此外,C.fructicola菌株PAFQ31在接种叶片和果实上产生黑点,而菌株PAFQ32在接种叶片和果实上形成凹陷坏死斑,表明C.fructicola存在两种不同致病类型的菌株。进一步选取43个代表菌株,以‘黄冠’梨果实为接种材料进行致病力评估,结果显示刺盘孢种间的致病力明显不同,同种的不同菌株其致病力亦有差异。这表明来源于我国不同地区和梨种的炭疽病菌之间存在明显的致病力分化。2.果生刺盘孢及其侵染梨叶片的转录组分析。以C.fructicola两种不同致病型菌株PAFQ31和PAFQ32为材料,对其接种后不同时期(未显症:潜伏期和显症:致病期)的砂梨叶片分别进行转录组测序。质控结果显示,各处理组获得7.01–11.29Gb的高质量clean base,碱基质量值Q20和Q30均符合高质量要求。使用DESeq2软件分别对引起不同症状的C.fructicola及其侵染后的梨叶片的转录组数据进行差异表达基因(DEGs)的筛选。侵染梨叶片的C.fructicola菌株PAFQ31和PAFQ32中,分别获得5461和10611个DEGs(2倍及以上的差异表达)。接种菌株PFAQ31和PFAQ32的梨叶片样品中,分别获得4282和5834个DEGs。通过对DEGs的聚类热图分析显示,C.fructicola潜伏期与致病期的DEGs虽有重叠,但主要表现为阶段特异性表达。潜伏期的梨叶片DEGs与对照组DEGs的表达模式较为相似,但与致病期存在显著差异,推测C.fructicola进入致病期时,梨叶片才开始激活多重防御手段对抗C.fructicola的侵害。此外,菌株PAFQ31和PAFQ32致病期的梨叶片中的DEGs差异较明显,表明梨叶片在应对不同病原菌致病时采取的防御策略可能有异。对差异表达基因的GO分类及KEGG富集分析,显示C.fructicola在致病期较潜伏期进行更为旺盛的合成、降解和能量代谢;寄主通过激活多阶段的免疫系统来抵御C.fructicola的侵害。3.寄主梨叶片防御策略的解析及C.fructicola候选效应子的预测。通过对C.fructicola侵染的梨叶片的不同代谢通路进行分析,明确PTI、ETI、植物激素免疫、类黄酮和苯丙烷类代谢等均参与了梨叶片对C.fructicola的抵抗过程。此外,多种类型的转录因子参与调控植物的一系列免疫反应。通过比较寄主梨叶片对病原菌C.fructicola中两种不同症状表现的菌株的侵染采取的防御策略,发现以上防御途径均存在差异,但激素信号转导通路差异最为明显。其中,SA信号通路在梨叶片抵御菌株PAFQ32的致病中发挥重要作用,JA和ET信号等信号通路处于抑制状态;而梨叶片主要通过ET、ABA和JA信号通路间的交互作用共同抵御菌株PAFQ31的侵染。此外,本研究根据效应子的特点,以C.fructicola菌株PAFQ31侵染时期的DEGs为对象进行候选效应子的筛选,共鉴定出65个候选效应因子,其中有18个效应因子在菌株PAFQ31侵染梨叶片的过程中显著上调表达。从中挑选出两个显著上调的候选效应子(CfCP1和CfE1)进行了序列分析,发现其在不同物种间比较保守且广泛存在于子囊菌中。荧光定量实验证明了CfCP1和CfE1基因在C.fructicola侵染时期都显著上调表达,表明其可能参与C.fructicola对梨叶片的侵害。


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