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菘蓝抗菌基因的分离鉴定及作用机制研究

吴佳  
【摘要】:植物病原菌抗药性严重影响作物病害的有效防控,多抗性细菌的产生更是威胁到动植物以及人类健康,抗菌肽(AMPs)因具有强大的抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗寄生虫、抗炎症和抗肿瘤等特性而备受关注,进而被挖掘出来作为新的蛋白农药和生防制剂。十字花科植物菘蓝是一种传统的中药材,具有多种药理作用而广为人知,包括抗病原微生物、抗肿瘤、抗白血病、提高免疫力、抑制血小板聚集、解毒、抗炎症、抗过敏等作用。枯草芽胞杆菌被认为是研究外源蛋白表达的合适宿主,在分泌表达过程中不产生内毒素,并且能直接将蛋白分泌到细胞外,是广泛用于生产异源蛋白的理想宿主。本研究利用枯草芽胞杆菌表达系统分离和筛选菘蓝中的AMPs,旨在探索出新的AMPs,为抗药性病菌的有效药剂开发提供可能的解决方案。本研究的主要结果如下:1. 成功构建菘蓝c DNA文库,并筛选出候选抗菌肽。菘蓝c DNA文库的滴度为5.6x 10~6 CFU/m L,初步筛选出14个对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有强大的抑菌活性的候选抗菌肽编码基因,选取Ii R515和Ii R915基因做进一步研究。结果表明Ii R515和Ii R915基因编码的抗菌肽能够显著抑制灰葡萄孢B05.10的生长。构建Ii R515和Ii R915的His-tag融合蛋白表达载体,表达并纯化得到纯蛋白,Ii R515和Ii R915对4种不同指示菌(小麦苗枯病菌1.1999、番茄溃疡病菌YCKYBI、水稻白叶枯病菌XG-25和劳尔氏青枯菌R21-5)的MIC范围分别为10-20μM和15-25μM。所得序列在NCBI数据库中比对分析,结果显示无相似性较高的序列,在抗菌肽数据库中也没有发现同源序列,所以,推测Ii R515和Ii R915为全新的抗菌肽。2. Ii R515和Ii R915稳定性较好,具有广泛的应用潜力。在100℃条件下加热15 min后,仍具有较强的抑菌活性,属于热稳定型AMPs。Ii R515和Ii R915在p H范围为3-9时,具有较稳定的抑菌活性,在365 nm紫外线,照射距离100 cm条件下持续照射150分钟后抑菌活性仍不受影响。用7种不同的酶(蛋白酶E,蛋白酶K,胃蛋白酶,胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,α-淀粉酶,脂肪酶)处理抗菌肽Ii R515和Ii R915,结果显示Ii R515和Ii R915可以被蛋白酶K和蛋白酶E降解。用UREA、EDTA、SDS和TWEEN-20四种化学试剂处理抗菌肽后,发现其抑菌活性不受影响。3. Ii R515和Ii R915在不同植物盆栽试验上能明显控制作物病害的发生。Ii R515和Ii R915对土传病害病原菌小麦苗枯病菌1.1999和番茄溃疡病菌YCKYBI有明显的抑制作用。离体叶片测试结果显示Ii R515和Ii R915对水稻细菌性条斑病菌RH3具有抑制作用。抗菌肽Ii R515和Ii R915还能明显抑制辣椒疫霉病菌LT263在烟草上的侵染和扩展。将Ii R515和Ii R915构建到病毒载体上转入根癌农杆菌EHA105中,在本氏烟体内进行瞬时表达,结果表明Ii R515和Ii R915能够显著抑制灰霉病菌B05.10在烟草叶片上引起的坏死斑。4. Ii R515和Ii R915对动物较安全,对哺乳动物红细胞无溶血性。Ii R515和Ii R915对秀丽隐杆线虫N2有明显的趋避作用,但不具有杀线活性。用转基因芽胞杆菌喂食线虫后,与喂食对照菌株WB800-e相比,各处理的线虫繁殖力没有显著变化,线虫虫体长度也无显著差异。溶血性测定结果表明Ii R515和Ii R915几乎无溶血作用,对哺乳动物和人类安全,为将来在临床上应用提供可能性。5. 抗菌肽抑菌的作用机制多种多样,主要是通过与病原菌相互作用以增强其细胞壁和细胞膜通透性来达到杀菌的目的。扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)的结果显示,与WB800-e相比,Ii R515和Ii R915转基因菌株表面呈现出皱缩、扭曲、变形甚至形成穿孔,细胞完整性明显受到破坏。在激光共聚焦显微镜(CLSM)下,Ii R515和Ii R915转基因菌株被碘化丙啶(PI)染色,显示出红色荧光。流式细胞分析表明与对照菌株相比,转基因菌株细胞的荧光强度和细胞内颗粒复杂程度明显增高。Ii R515和Ii R915转基因菌株细胞膜流动性监测也显示出与对照WB800-e相比,细胞膜内部流动性明显降低。随着孵育时间的增加,Ii R515和Ii R915菌株细胞膜的膜电位(ΔΨ)也显著增加。这些结果表明抗菌肽Ii R515和Ii R915可能的作用机制是损伤和破坏细胞膜结构。


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