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豆血红蛋白调控根瘤高效固氮的分子机制研究

王龙龙  
【摘要】:血红蛋白(Hemoglobin,Hb)大量存在于人体红细胞中,能够携带氧气并将其传递至各个需氧器官,是人体正常生理活动不可或缺的。植物中也存在多种类型的血红蛋白,根据其功能主要分为两大类:非共生血红蛋白(ns Hb)和共生血红蛋白(s Hb)。非共生血红蛋白广泛存在于植物各个组织中,而共生血红蛋白则主要存在于植物-微生物互作形成的固氮根瘤中,其中豆科植物中广泛存在的一类共生血红蛋白被称作豆血红蛋白(Leghemoglobins,Lbs)。根瘤内的根瘤菌可以利用自身编码的固氮酶将大气中的氮气还原为氨,然而固氮酶对于氧气极其敏感,过量的氧气将破坏固氮酶结构并导致其丧失固氮活性。豆血红蛋白存在于固氮根瘤的细菌侵染细胞中,通过独特的氧结合与氧解离的特性创造低氧环境,在保证固氮酶活性的前提下,为类菌体和线粒体提供了细胞呼吸所需的氧气。虽然针对豆血红蛋白的研究已有很长的历史,但目前仍存在一系列重要科学问题尚未解决。本研究围绕豆血红蛋白基因的生物学功能、转录调控机制及其辅基血红素来源等方面开展了一系列深入探究。本研究以百脉根为模式植物,利用CRISPR技术成功敲除了其编码的三个豆血红蛋白基因(Lj Lb1,Lj Lb2,Lj Lb3)。通过对单基因、双基因和三基因突变体的表型鉴定及遗传回补,发现三个Lbs协同调控了根瘤的高效固氮,其贡献具有叠加效应。另外,非共生血红蛋白不能互补三基因突变体的缺氮表型,而非豆科来源的共生血红蛋白则可以部分互补该表型,这说明共生血红蛋白在固氮根瘤发挥的特殊功能是非共生血红蛋白所不具备的,同时也揭示了豆科、非豆科共生血红蛋白的趋同进化模式。进一步针对lb三突变体展开的系统性研究揭示了突变体根瘤显微结构的变化,包括:裂解液泡的产生、PHB积累及线粒体形态异常等。RNA-seq分析发现,差异表达基因中除了包括碳代谢和氮代谢途径相关基因外,还包括一系列转录因子、蛋白酶等。另外,Lb的缺失导致根瘤侵染细胞内出现严重ROS和NO积累,说明Lb除了结合和传递氧气之外,还可能参与维持了根瘤内部ROS和NO的平衡。这些结果为深入研究Lb生物学功能以及根瘤衰老调控机制奠定了良好的基础。作为最早被鉴定的结瘤素基因,豆血红蛋白的转录调控机制一直是共生固氮领域的研究重点。Lb启动子序列中已有大量顺式作用元件被鉴定,但是调控Lb侵染细胞特异性表达的转录因子目前仍不清楚。针对Lj Lb1/2/3的时空表达模式分析发现,三个Lbs表达模式趋于一致,在根瘤菌定殖后被诱导表达,随着根瘤的发育表达量逐渐升高,在成熟根瘤中达到最高,且主要集中在根瘤侵染细胞中表达,随后根瘤进入衰老阶段,Lbs表达量随之下降。另外,启动子截短实验发现,调控三个Lbs根瘤特异性表达的顺式作用元件位于Lbs基因ATG上游约300 bp内。以该300 bp的DNA片段为诱饵开展酵母单杂交和DNA pull down实验,鉴定到数十个可能结合Lb启动子并调控其转录的候选蛋白,后续将对这些蛋白进行进一步的筛选鉴定,综上所述,这些结果对于系统解析Lb侵染细胞特异的转录调控机制具有重要意义。血红素作为豆血红蛋白的辅基,是Lb行使功能所必需的组分。在根瘤共生体系中,质体与类菌体均具备合成血红素的能力,但是与豆血红蛋白结合的数量庞大的血红素分子究竟来自何处目前仍不清楚。本研究从植物的角度出发,试图阐释质体血红素合成相关基因在根瘤共生固氮过程中的重要功能。Glu TR(Glutamyl-t RNA reductase)催化了植物血红素合成通路的限速步骤,本研究针对百脉根中三个Glu TR基因(GTR1,GTR2,GTR3)的时空表达模式进行了系统分析,发现GTR2在根瘤侵染细胞中被诱导表达,而GTR1/3在根瘤固氮区无明显表达。利用CRISPR的方式敲除GTR1,GTR2或GTR12,并没有引发明显的共生缺陷表型。而超量表达植物血红素合成的负调节子Flu导致根瘤由红色变为白色,地上部分生物量较对照有显著降低。这些数据说明,豆血红蛋白辅基血红素可能主要是由植物血红素合成通路相关基因负责合成的。综上所述,本研究系统解析了百脉根豆血红蛋白基因(Lj Lb1,Lj Lb2,Lj Lb3)协同调控根瘤高效固氮的分子机制,揭示了Lb参与维持ROS和NO稳态的生物学功能;初步鉴定了参与Lb细胞特异性转录调控的潜在转录因子;通过对Glu TR和Flu等植物血红素合成通路相关基因在根瘤体系中的研究,确立了植物血红素合成对于根瘤总体血红素水平的重要贡献。这些研究结果将有力推动Lb生物学功能、Lb转录调控机制和成熟根瘤高效固氮的分子机制等方面的研究进展。


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