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软枣猕猴桃果实花色苷合成与调控的分子机制

李玉阔  
【摘要】:猕猴桃是起源于中国的多年生落叶藤本果树,在分类上属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl.)。该属植物种质资源丰富,共有75个分类单元,包括54个种和21个变种。猕猴桃果实味美汁多,富含维生素C和多种矿物质,营养价值很高。猕猴桃的果实性状多种多样,色泽作为直观的性状影响果实的外观品质并关乎消费者的购买意愿,直接决定猕猴桃的商品价值。猕猴桃果实颜色主要有绿色、黄色和红色,与之对应的代谢过程分别为叶绿素、类胡萝卜素和花色苷代谢。花色苷的合成与积累是猕猴桃果实呈现红色的直接因素,因此,开展猕猴桃果实花色苷合成的分子机制对红色猕猴桃品种的遗传改良非常重要。尽管猕猴桃花色苷合成的相关研究已有报道,但具体的分子调控机制并不清楚,且多数研究集中在果实局部红色的中华猕猴桃中,关于全红型软枣猕猴桃果实花色苷的研究相对较少。本研究以不同颜色的软枣猕猴桃果实为试验材料,对其进行代谢组分析和小RNA测序,筛选花色苷合成与调控的关键因子并对其功能进行验证,探讨软枣猕猴桃果实花色苷合成与调控的分子机制,主要研究结果如下:1.代谢组分析筛选着色相关的代谢物。对全红型软枣猕猴桃‘红宝石星’和全绿型软枣猕猴桃‘永丰一号’果实样品进行代谢组分析,共鉴定到28,837个代谢物,其中能够匹配到一级和二级数据库并成功注释的代谢物有13,715个。‘红宝石星’转色期和转色前期相比,共有3,785个代谢物上调,其中41个代谢物属于类黄酮物质,达到显著性差异的共7个,其中4个参与花色苷生物合成,分别为二氢杨梅素、矢车菊色素、天竺葵色素和飞燕草色素,表明这4种差异代谢物在‘红宝石星’果实转色过程中可能起到关键作用,转录组和代谢组关联分析和基因表达谱验证结果显示F3H、LDOX和UFGT是花色苷合成路径中的关键结构基因。2.小RNA测序分析筛选关键调节因子。对‘红宝石星’颜色变化关键期的果实样品进行高通量小RNA测序分析,共鉴定到1,063个mi RNAs,包括482个保守的mi RNAs(对应526个前体mi RNAs)和581个新型mi RNAs(对应619个前体mi RNAs),分属46个mi RNA家族。‘红宝石星’果实着色过程中,共有321个mi RNAs显著性差异表达。将321个mi RNAs进行靶基因预测并将预测结果比对到GO和KEGG数据库获得相应的功能注释数据。结果显示,共有814个靶基因分别注释到GO分类的25个生物学过程条目、15个细胞组分条目和10个分子功能条目,共有207个靶基因被匹配到KEGG分类的18个条目中。这为后续筛选关键mi RNA提供重要数据参考。依据花色苷合成基因表达谱、基因表达水平与花色苷组分含量相关性分析、mi RNA表达水平检测、mi RNA与靶基因的序列比对等结果筛选到可能参与调控花色苷合成的绿果期特异高表达的mi R858及其靶基因Aa MYBC1。3.调节因子的功能验证。通过基因组定位分析,发现mi R858定位于猕猴桃基因组的第13号染色体的1.2 Mb区域,靶基因Aa MYBC1定位于第9号染色体的0.8 Mb区域。靶位点位于Aa MYBC1编码区的289-309 bp区段。从‘红宝石星’中克隆Aa MYBC1基因,其c DNA全长798 bp,编码265个氨基酸。通过功能蛋白网络数据库预测发现Aa MYBC1可能与Aab HLH42之间存在互作关系。分别构建Aa MYBC1-p GBKT17和Aab HLH42-p GADT7重组载体共转化酵母细胞进行酵母双杂交试验,结果表明Aa MYBC1能够与Aab HLH42互作。亚细胞定位结果表明Aa MYBC1定位于细胞核,Aab HLH42定位于细胞核和细胞质,两者均具有转录因子的一般特性。构建mi R858表达载体、Aa MYBC1靶位点正常和突变载体并转化农杆菌,瞬时共转化本氏烟草证实mi R858与Aa MYBC1的靶向关系。4.在软枣猕猴桃‘红宝石星’离体果实的果心中过表达mi R858,与对照相比,过表达mi R858的果心不能正常着色,花色苷几乎检测不到,Aa MYBC1和花色苷合成的晚期合成基因表达量显著降低,表明mi R858通过抑制Aa MYBC1的表达阻碍花色苷的合成与积累,进而抑制果实着色。构建Aa MYBC1的沉默载体并在‘红宝石星’果心中瞬时沉默Aa MYBC1,与对照相比,沉默Aa MYBC1的果心红色明显变浅,花色苷含量显著降低,Aa MYBC1和花色苷合成的晚期合成基因表达量显著降低,表明单独沉默Aa MYBC1能够减弱花色苷的合成,进而干扰果实着色,但不能完全抑制。5.基于以上结果,推测红绿软枣猕猴桃果实颜色差异的形成源于mi R858的差异表达调控。通过对‘红宝石星’进行套袋和不同温度处理,发现遮光和高温能够显著诱导mi R858的表达从而抑制果实着色。构建mi R858介导的全红型软枣猕猴桃果实响应环境因素的花色苷合成的调控模型:在果实正常生长条件下,Aa MYBC1和Aab HLH42能够与另外一个WD40蛋白形成MBW复合体,激活花色苷晚期合成基因的表达,进而促进花色苷的合成与积累,果实正常着色。在果实处于高温或者光照不良等环境胁迫下,mi R858被诱导表达,抑制其靶基因Aa MYBC1的表达,使其不能正常形成Aa MYBC1转录因子,干扰MBW复合体的形成,不能激活花色苷晚期合成基因的表达,进而抑制花色苷的合成与积累,果实不能正常着色。本研究利用多组学分析,系统研究了软枣猕猴桃果实花色苷合成的分子机制,初步分析了红绿果实差异形成的原因,构建了mi R858介导的软枣猕猴桃果实花色苷合成与调控的网络作用模型,为猕猴桃果实着色机制提供了新的视点,为猕猴桃果实红色性状的遗传改良提供理论基础,对分子育种指导生产具有重要意义。


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