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棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析

吴朝峰  
【摘要】:棉花是世界上最重要的经济作物之一,棉籽是纤维和蛋白的重要来源。然而,存在于色素腺体的棉酚毒素限制了棉籽的开发利用,长时间食用棉酚,会引起人和单胃动物消化系统的代谢紊乱。同时,棉酚又是棉花体内特有的天然毒素,能提高棉株对某些真菌、病害和虫害的拮抗作用。因此,挖掘色素腺体发生的相关基因、解析腺体形成的分子机制、选育低酚棉品种一直是育种家孜孜追求的目标和方向。基于棉花色素腺体2套近等基因系叶片转录组数据比较分析,我们获得了一个差异表达的AP2/ERF转录因子,命名为Gh ERF105。为了探究其功能,通过生物信息学、基因表达、乙烯诱导、VIGS、酵母单(双)杂等方法对其进行分析。主要研究结果如下:(1)Gh ERF105基因编码区全长711bp,编码236个氨基酸。蛋白质分子量为26.26k Da,理论p I 7.72。二级结构预测存在α-螺旋(22.88%),β-转角(3.81%),延伸链(13.14%)和无规则卷曲(60.17%)。Gh ERF105蛋白在第91-155个氨基酸之间存在1个AP2结构域。亚细胞定位预测Gh ERF105可能位于细胞核。进化树分析显示Gh ERF105蛋白与海岛棉、亚洲棉、陆地棉和雷蒙德氏棉中的同源蛋白的相似性较高,说明该类蛋白在棉属的进化中比较保守。(2)利用荧光定量PCR对无腺体和有腺体棉花材料及不同组织部位中Gh ERF105基因的表达情况进行分析。结果表明,Gh ERF105基因在有腺体陆地棉品种中棉所12、17、辽7和陆地棉遗传标准系TM-1的叶片和茎中相对表达量均高于显性无腺体品种中棉所12、辽7和隐性无腺体品种中棉所12、17。同时,该基因在有腺体陆地棉中棉所12子叶、真叶、叶柄、下胚轴、茎、花萼、花瓣及铃壳等部位的相对表达量明显高于无腺体棉中棉所12。推测Gh ERF105基因可能与腺体形成有关。(3)利用VIGS技术对Gh ERF105基因进行功能分析,发现Gh ERF105基因沉默后,有腺体中12植株新生的叶片腺体数目大幅度减少和棉酚含量降低。证明Gh ERF105基因参与叶片腺体形成和棉酚合成。(4)将Gh ERF105和GFP蛋白融合构建p BI121-Gh ERF105-GFP表达载体,将其注射烟草叶片进行亚细胞定位,结果发现Gh ERF105-GFP蛋白在烟草细胞核中表达。利用酵母单杂交实验证明Gh ERF105基因能够特异性识别和结合靶基因启动子上的GCC-box和DER作用元件,表明Gh ERF105是一个典型的ERF转录因子。(5)以有腺体陆地棉品种中棉所12和显性无腺体品种中棉所12为材料,克隆了Gh ERF105基因上游2000 bp的启动子序列并对其进行初步分析,生物信息学分析表明,Gh ERF105基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及光调控元件,ABRE,ARE,ERE,GCN4-motif,TC-rich repeats等多个顺式作用元件。诱导表达分析表明Gh ERF105明显受乙烯利诱导上调表达,在喷施乙烯利8 h后,Gh ERF105表达量达到最高值,表明Gh ERF105基因参与到乙烯信号转导途径。(6)构建酵母诱饵表达载体p DHB1-Gh ERF105,并对其进行自激活和毒性检测。结果显示,诱饵蛋白Gh ERF105不能单独启动NMY51菌株中报告基因表达,并且对酵母细胞无毒性。通过酵母双杂交实验共筛选到52个可能与Gh ERF105互作的蛋白,挑选出7个蛋白质再次进行共转验证和α-galactosidase检测,结果表明这7个蛋白质均与Gh ERF105蛋白互作。同时,采用双分子荧光互补试验进一步确认了互作结果。综上所述,Gh ERF105基因可能通过乙烯信号通路来参与棉花色素腺体的形成,为解析棉花腺体形成的分子机制提供理论依据,为培育新的低酚棉品种提供候选基因和辅助筛选标记。


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