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H5和H7亚型禽流感病毒鸡和鸭血清抗体检测胶体金试纸条的制备与初步应用

崔艺洁  
【摘要】:H5和H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)感染禽类后导致较高的病死率,严重危害家禽养殖业。自然环境中多种家禽和野鸟均易感染,部分毒株还可感染人类,对养殖禽类进行疫苗免疫可有效防控此病,因此,免疫后的抗体水平监测对免疫状态的评估尤为重要。胶体金试纸条作为操作简便、灵敏特异的产品广泛应用于鸡场的抗体水平检测。鉴于市场中缺少针对鸡、鸭等易感禽类AIV抗体检测的通用型胶体金试纸条,本研究应用一株小鼠抗多种家禽IgYFc片段单克隆抗体作胶体金标记物,该单抗能与鸡、鸭等多种禽类血清反应,分别针对H5和H7亚型AIV研制出适用于鸡和鸭血清抗体检测的胶体金试纸条,既能对未免疫禽群感染H5和H7亚型AIV进行快速诊断,也能监测免疫禽群的抗体水平。主要研究结果如下:1.两种重组蛋白的表达与鉴定将重组表达质粒pGEX-KG-HA1_5和p GEX-KG-HA1_7分别在大肠杆菌中进行表达,并纯化两种表达产物,得到大小为63KDa的HA1_5重组蛋白和61KDa的HA1_7重组蛋白。Western Blot检测结果表明这两种蛋白的反应原性和特异性良好。2.鼠抗禽IgYFc片段单克隆抗体的纯化利用辛酸-硫酸铵法纯化小鼠腹水,该腹水由小鼠抗多种家禽IgYFc片段单克隆抗体生产的杂交瘤细胞株10A1注射小鼠所产生,纯化后获得了高纯度的单克隆抗体。3.H5亚型AIV抗体检测胶体金方法的建立鼠抗禽IgYFc片段金标单抗作指示物质,羊抗鼠Ig G(0.1mg/m L)划为C线,AIV-HA1_5蛋白(0.5mg/m L)划为T线,单抗标记量8μg Mc Ab/m L胶体金,标金p H为每毫升胶体金加入9μL 0.1mol/L K_2CO_3溶液,吸水垫CH37K,金标垫Fusion4,血清样品垫XQ-Y7,C线和T线的蛋白稀释液选用包被液3(以p H7.2的PB为基础缓冲液),金标喷量5μL/cm。该试纸条特异性和重复性好,4°C条件下可保存六个月;检测免疫的鸡血清和鸭血清共152份,与HI方法相符的有140份,符合率为92.11%(140/152),检测未免疫的鸡血清和鸭血清共14份,试纸条检测结果均为阴性,表明本试纸条可用于鸡和鸭血清抗体效价的测定。4.H7亚型AIV抗体检测胶体金方法的建立鼠抗禽IgYFc片段金标单抗作指示物质,羊抗鼠Ig G(0.1mg/m L)划为C线,AIV-HA1_7蛋白(0.3mg/m L)划为T线,单抗标记量8μg Mc Ab/m L胶体金,标金p H为每毫升胶体金加入9μL 0.1mol/L K_2CO_3溶液,吸水垫CH37K,金标垫Fusion4,样品垫NJ-Y8,C线和T线的蛋白的稀释液选用包被液2(以p H8.2的TBS为基础缓冲液),金标喷量6μL/cm。该试纸条特异性和重复性良好,4°C条件下可保存三个月;检测免疫的鸡血清和鸭血清共167份,与HI方法相符的有158份,符合率为94.61%(158/167),检测未免疫的鸡血清和鸭血清共14份,试纸条检测结果均为阴性,表明本试纸条可用于鸡和鸭血清抗体效价的测定。


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