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弓形虫GRA7单克隆抗体制备及猪弓形虫病阻断ELISA检测方法的建立

张静  
【摘要】:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种人畜共患寄生原虫,呈世界性分布。作为单细胞寄生虫,它几乎可以感染所有的温血动物。弓形虫通过侵染宿主有核细胞,从而引起宿主多种组织、器官发生损害和病变。据统计,全球有超过1/3的人口感染弓形虫病。除了人类,弓形虫还能感染200多种动物并致其发病,其中猫科动物为弓形虫唯一终末宿主,猪的弓形虫感染率最高。中国作为生猪养殖大国,弓形虫感染率在4.8%~85.7%之间,且地域差异较大,该病大规模在猪群及畜禽厂中的传播,给畜牧业尤其生猪养殖业造成重大的经济损失。同时我国也是猪肉消费大国,猪作为弓形虫重要的中间宿主,在弓形虫的传播过程中起到十分重要的作用。因此,建立一种快速准确的实验室检测方法是防控弓形虫病的重要措施之一,对保护实际生产起非常重要的作用。本研究利用实验室保存的质粒pET-28a-GRA7原核表达了重组GRA7蛋白,通过试验证明该重组蛋白具有良好特异性;免疫BALB/c小鼠,取脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法进行杂交瘤细胞的筛选,通过复检与亚克隆后选取了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,命名为A3D,B6G,F9B及KIF,其中B6G细胞培养上清的抗体效价最高,为2.24×10~5。Western Blot和IFA实验证明四株单克隆抗体均能与重组GRA7蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性,最终选择单克隆抗体B6G进行阻断ELISA方法建立。逐步优化阻断ELISA的最佳反应条件,经过特异性试验和重复性试验,发现所建立的阻断ELISA方法具有特异性强,符合率高和重复性好的特点,用该方法对临床288份临床样品进行检测,发现该批样品中的弓形虫抗体阳性率为11.46%,与MAT复检阳性重合率为84.9%,表明该方法能用于临床样品中弓形虫抗体的检测。


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