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利用枯草芽胞杆菌表达系统进行马铃薯抗菌基因的筛选

郭鹏飞  
【摘要】:抗菌肽是植物先天免疫系统的重要组成部分,它具有良好的广谱抗菌活性,因此作为抗生素的替代品有较好的应用前景。马铃薯野生种(Solanum demissum)作为重要的种质资源,含有丰富的抗性基因。指示菌内置文库抗性基因筛选技术是我们课题组前期新建立的一项技术,即把基因表达文库转入病原指示菌体内,让这些表达的外源蛋白在指示菌内部起抑菌作用,从而高效灵敏地筛选克隆抗菌基因。本研究利用指示菌内置文库抗性基因筛选技术,通过枯草芽胞杆菌表达系统建立起马铃薯野生种(S.demissum)c DNA文库,以自溶现象作为筛选标准,从文库共3650个转化子中初步筛选得到37个具有稳定自溶现象的单克隆菌株。检测这些自溶菌株胞外蛋白的抑菌活性后,选择对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有显著抑菌效果的菌株Sd R2332和Sd R2770进行后续的研究。我们分别测定了Sd R2332和Sd R2770的热稳定性、酶稳定性和紫外稳定性,结果发现经过50℃和80℃温度处理后,Sd R2332和Sd R2770抑菌活性无显著变化;而经100℃高温处理后,Sd R2332和Sd R2770活性有一定程度的下降;在酶稳定性实验中,经胰蛋白酶和脂肪酶处理后抗菌肽的抑菌活性无明显变化,但经其余五种蛋白酶处理后Sd R2332和Sd R2770的抑菌活性均有不同程度的下降;而经过紫外处理2h与4 h后,抗菌肽的抑菌活性无明显变化。这说明抗菌肽Sd R2332和Sd R2770具有优良的热稳定性、紫外稳定性以及对胰蛋白酶和脂肪酶的酶稳定性。利用His-tag及蛋白酶(Tobacco Etch Virus,TEV)标签对抗菌肽Sd R2332和Sd R2770进行纯化后,将其进行SDS-PAGE电泳,得到Sd R2332和Sd R2770的条带大小分别约为9.1 k Da、3.6 k Da,与预测一致。我们测定了抗菌肽Sd R2332和Sd R2770的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC),选取多粘菌素B(MIC:5.00-25.0μM)作为阳性对照,结果表明抗菌肽Sd R2332(MIC:14.70-27.0μM)和Sd R2770(MIC:8.20-20.0μM)对革兰氏阳性菌和阴性菌均表现出了优良的广谱抗菌活性,在低浓度下即可杀伤病原菌。溶血性实验结果表明,即使在5×MIC浓度下,抗菌肽Sd R2332和Sd R2770对小鼠红细胞的溶血活性仍低于5%,表明抗菌肽Sd R2332和Sd R2770对哺乳动物基本无毒害作用。对抗菌肽Sd R2332和Sd R2770作进一步的抗菌机制研究,发现经抗菌肽Sd R2332和Sd R2770处理后的青枯菌(Ralstonia solancearum)出现了明显的活性氧迸发现象,表明抗菌肽可引起病原青枯菌的免疫反应。在扫描电镜下观察发现青枯菌细胞有一定程度的皱缩和破损,说明抗菌肽可能是通过破坏病原菌的细胞膜来进行抑菌的。通过q RT-PCR分析,发现接种青枯菌后,马铃薯植株中Sd R2770基因的表达量显著上调,推测其可能与植物抗病相关,但Sd R2332的表达量无明显波动变化。综上所述,本研究利用枯草芽胞杆菌表达系统筛选得到了两个新型且具广谱抑菌活性的新抗菌肽Sd R2332和Sd R2770,它们具有稳定的理化性质且对人畜较为安全,有助于后续对马铃薯野生种(S.demissum)抗性基因的功能进行进一步的研究。


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