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水稻抗白叶枯Xa4基因及其等位基因的克隆以及相关基因家族的分析

孙新立  
【摘要】: 水稻是重要的粮食作物,感染白叶枯病后,会严重影响水稻的产量和品质。水稻抗白叶枯病Xa4基因是显性,全生育期抗病基因,曾广泛应用在中国和亚洲其它国家的抗病育种中,该基因对中国流行的所有优势白叶枯生理小种都具有抗性。对该基因的克隆,是研究其抗病机理与改造和利用这一基因的基础。 利用约3000株的IR24和IRBB4(IR24的近等基因系)杂交F_2群体,首先将Xa4抗病基因定位在第11染色体的R1506和S12886之间,Xa4基因距两个标记各0.5cM。利用明恢63 BAC文库,建立了跨越该区段,Contig长度不少于500 kb的物理图谱,并进一步利用明恢63/BAC亚克隆对基因定位,最后,将Xa4基因框在X4-88和M196-1之间,这两个标记都处在明恢63/3H8上。 对明恢63/3H8测序,发现X4-88和M196-1间的物理距离约47 kb,该区段包含一个和Xa21同源性很高的LRR-Kinase基因(RKa)和其它的几个不表达的基因,推测明恢63上的这个LRR-Kinase基因是Xa4的等位基因。对IR24/IRBB4杂交产生的突变体的分析同样表明以RKa基因就是Xa4基因。分析明恢63/3H8序列酶切图谱,采用Spe Ⅰ对IRBB4—DNA的酶切,回收12 kb左右的片段,连接、筛选,所得片段包含完整的RKa基因,与在特青/26N11上获得的片段在RKa的编码区完全相同。RKa基因编码一个包含26个LRR的受体激酶。将两个片段转化感病的品种,转化工作正在进行之中。同时将明恢63/RKa和明恢63/3H8上另一个表达的LRR-Kinase基因(RKb)进行了转化,结果发现转明恢63/RKb的植株表现出很强的对PXO61的抗性。该抗性和转化的明恢63/RKb共分离。 采用获取Xa4基因的策略,从带有Xa3基因的IRBB3和带有Xa22的扎昌龙(ZCL)分别获取了一个约19 kb的片段,为Xa4基因的同源片段。对这两个片段的测序分析表明,它们编码RKa和RKb两个基因,编码区和明恢63的序列完全相同。这些结果暗示很有可能明恢63/RKb基因就是Xa3基因,Xa22基因亦和Xa3基因相同。而该基因在明恢63中表现出弱的抗病性可能是由于在明恢63的内部存在抑制因素的原因。 对感病品种IR24的RKa基因测序,将IR24/RKa和IRBB4/RKa、明恢63/RKa比较,在IR24中,有一小段序列插入了RKa的羧基端,这是由于基因的尾部的重复造成的。其余区段与IRBB4相比仅有4个氨基酸的差异,和明恢63有18个氨基酸的差异,这些差异中,只有在LRR21中的一个精氨酸,是IR24独有的。 明恢63和特青抗病基因家族都包含3个完整的LRR-Kinase基因,分别为 水稻抗白叶枯Xa4基因及其等位基因的克隆以及相关基因家族的分析 RKa、RKb和RKc。在IRBB4、IR24、明恢63、IRBB3和ZCL中,都能检测到 RKa和RKb在成株期叶片中的表达,这两个基因的表达不受病原菌的诱导,而 未检测到RKc的表达。对来自明恢63的不同组织的RNA进行表达分析,在苗 期的叶、叶鞘、分孽期的叶和根中检测到RKa和RKb的表达,而在抽穗期的茎 和穗中没有检测到。 对明恢63和特青抗病基因家族的对比分析发现,二者相差很大,但RKa、 RKb和 RKc之间的排列顺序和转录方向二者相同。在RKa和RKb、RKb和RKc 之间以及RKc后,特青中有LRR一Kinase的残片存在,而明恢63中没有。两个 Hapfotype间的同源区较短,一般仅出现在基因的编码区。对来自华大水稻基因组 数据库的93一11相关序列的分析表明,所得93一n序列的大部分区段和特青的 同源性很高,一般只表现为个别碱基的差异,与明恢63的序列差异很大。在RKe 和RKb基因附近,93一11和特青相比,存在一段512bP的缺失和两短较低的同 源区。这两段低同源区的出现可能是由于同源重组造成的。但造成缺失的原因 不清楚。 将三个品种的RKa、RKb和RKc共9个基因编码的氨基酸序列进行聚类和 Clustalw分析,结果发现Orthologs间的同源性明显大于Paralogs之间的同源性。 聚类将9个基因明显的分为三类,分别对应于RKa、RKb和RKc,RKc与RKa、 RKb的遗传距离大于RK.a和RKb的遗传距离。编码区的核昔酸分析显示了类似 的结果。对比分析上面的基因的LRR结构域间和Kinase结构域间的差异,LRR 和Kinase在Orthologs间的氨基酸差异百分率很接近;而两个结构域在Paralogs 的差异率,LRR区明显大于Kinase区,差异显著。进一步对特青/26Nn中两 类不同的受体激酶进行分析,RLK的这种同源性和它们在基因组中的物理位置 相关性很大,位置相近的同源性较高。根据这些比较分析,对明恢63爪apfotyPe 和特青爪apfotyPe形成过程进行了推测。


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