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泥鳅孵化腺发育及孵化酶生化特性的研究

梁宇君  
【摘要】: 鱼类的孵化破膜主要靠孵化腺细胞分泌的孵化酶消化卵膜,再加上胚体的扭动协助完成。研究鱼类的孵化腺的发育规律及其分泌物—孵化酶的生化特性是鱼类繁殖生物学、细胞发育生物学中的一项重要内容。目前我国大部分名贵、经济鱼类的繁殖都依靠人工繁殖,因此如何通过控制环境因子,使鱼类孵化能正常破膜,就成了制约鱼类繁衍的重要因素。本研究拟通对泥鳅孵化腺发育和孵化酶生化特性的研究,以深入认识鱼类孵化破膜的机制,为经济鱼类的人工繁殖以及保护濒危水生动物和控制有害水生动物提供理论依据,同时丰富相关学科领域的内容。 通过对泥鳅胚胎发育各时相的组织学观察发现,泥鳅的孵化腺细胞最早可在神经胚期鉴别出来。孵化腺细胞呈长椭圆形或棒状。孵化腺细胞最早出现在紧贴卵黄囊预定形成咽腔的部位,由此可断定泥鳅的孵化腺细胞起源于内胚层。在胚胎发育过程中,孵化腺细胞发生了迁移和增生,到视泡形成期孵化腺细胞已经迁移到了中胚层,成簇分布在头部,内含分泌颗粒;视泡中腔形成期,少数孵化腺细胞开始进行孵化酶分泌和排放;肌肉效应期和出膜前期孵化腺细胞的数量达高峰,同时出现部分排空现象,此时,孵化腺细胞已经迁移到了胚胎近体表处;出膜瞬期,大量孵化腺细胞呈现出排空状态,表明孵化腺细胞已进入退化阶段。出膜后24小时、36小时和48小时可观察到孵化腺细胞进一步排空和消失,呈现出全面退化乃至消亡的现象。根据观察,可认为孵化腺细胞从分化形成到退化经历了一个水平扩散和垂直迁移的过程,终末位置集中在胚体的眼眶周围、口咽腔壁和上下颌几个部位。 利用葡聚糖-G-100柱层析的方法对孵化液进行分离纯化及对层析得到的组分作体外消化卵膜的实验,鉴定得到泥鳅的孵化酶。孵化酶对卵膜的消化过程可为:首先将卵膜裂解成大的几个碎片,然后进一步裂解成大量细小的碎片,最后将卵膜溶解。将该酶作PAGE,发现该酶由两种组分组成,分别为HE_1和HE_2。对该酶进行SDS-PAGE,测得HE_1和HE_2分子量分别为75kDa和89kDa。 以1%的酪蛋白为底物,采用修改的kunitz法对泥鳅孵化酶活性进行测定,测得当孵化酶浓度为0.044~0.088 mg/mL时,该酶的比活力为2.7~3.2μg~(-1)min~(-1)。通过对不同温度和不同PH值下孵化酶活性变化的测定,显示孵化酶最适温度为28℃,当温度高于35℃或低于10℃时孵化酶的活性受到了显著抑制;PH为7.5~8.2时孵化酶活性最高,而PH低于6.5或高于9.0时显著降低。


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