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弗兰克氏菌的分子鉴定和遗传多样性研究

易犁  
【摘要】: 本研究课题对来自杨梅(Myrica)、木麻黄(Casuarina)、桤木(Alnus)和马桑(Coriaria)的13株Frankia菌纯培养的16S rRNA基因进行了PCR-RFLP分析和部分菌株的序列测定,初步探讨了弗兰克氏菌的遗传多样性和系统发育地位。包括以下主要内容及结果。 通过比较已发表的原核生物,如大肠杆菌、根瘤菌和弗兰克氏菌的16S rRNA基因全序列的保守区,设计了8对引物并筛选出可适用于扩增13株供试菌株16S rRNA基因接近全长序列的引物:UF/UR和Ec27f/Fr1717r(产物大小约1500bp)。进一步试验和序列测定发现利用引物UF/UR所得扩增产物的重复性更好,并在随后的RFLP分析中能较一致地揭示出供试菌株的遗传多样性。 用限制性内切酶AfaⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、HinfⅠ、MspⅠ和Sau3AⅠ分别对引物UF/UR和Ec27f/Fr1717r的扩增产物进行RFLP(限制性酶切片段长度多态性)分析。后经测序选取与16S rRNA基因更符合的引物UF/UR的扩增酶切结果进行进一步的聚类分析。根据酶切图谱,通过Popgen2软件计算各供试菌株之间的遗传距离;用Shannon信息指数计算种群遗传多样性;利用UPGMA法(Mega2软件)对所获得的遗传距离矩阵进行聚类分析,得到13株供试Frankia菌株间系统发育的聚类分析树状图谱。结果显示弗兰克氏菌种群内的遗传多样性较高,种群分化较大,13株供试Frankia菌株平均每个位点的多样性指数为0.4498。根据酶切聚类树状图谱将13株供试Frankia菌株分为4个不同类群:马桑类群、木麻黄—杨梅类群、杨梅类群和杨梅—桤木—木麻黄类群。其中,马桑类群表现出与其他类群有着明显的差异,暗示其可能具有独特的系统发育地位。这一结果与胡传炯等(1998)对马桑菌株Cs030进行nif—RFLP分析所得的结论以及Nick等(1992)在检测马桑根瘤内生菌的部分序列后所得的结论都是相一致的。此外,聚类分析还表明,不同宿主来源的菌株之间存在着交叉,特别是来自于木麻黄和杨梅的菌株,其交叉尤其明显。但是,研究供试菌株得到的分群与较细的宿主种类划分和宿主的地理分布并无密切相关。 选取其中5株供试菌株进行16S rDNA全序列分析,通过网上BLAST、计算机软件聚类分析和与其它已发表序列的菌株相比较进一步表明来自木麻黄和杨梅的菌株有着明显的交叉,它们的分群结果比较混杂。5株供试菌株与其它已发表菌株的全序列比较结果可将所有菌株大致划分为4个簇,杨梅菌株FMr61、木麻黄菌株FCg07和木麻黄菌株FCe42具有较高相似性与桤木菌株聚为第Ⅰ簇;而杨梅菌株FMr16和2215与来自胡颓子科和沙棘的菌株聚在一起归为第Ⅳ簇。这些结果与Baker(1987)通过交叉感染试验将来自不同宿主的50株Frankia菌株分成4个类群的结果部分一致,但也暗示其可能具有局限性;此外,分析杨梅和木麻黄菌株所得到的结论支持了Normand等(1996)与 华中农业大学硕十研究生学位论文 李志真(2002)所得的结论,即木麻黄和杨梅的菌株比较混杂,两者都不能成为独立的 类群。 本研究还尝试直接从植物根瘤中提取凡刁刀kz’a内生菌总DNA并对其165 rRNA基因 做PCR一RFLP分析的工作。由于材料和时间有限没有获得成功,但积累了不少经验,为 以后继续类似研究打下基础。


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