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绿色荧光蛋白基因标记苏云金芽胞杆菌及微量热特性

林晓燕  
【摘要】: 本研究主要围绕构建高效表达的GFP解离载体标记苏云金芽胞杆菌而开展的研究工作,主要研究结果如下: 1.利用小质粒复制区构建解离载体 利用Tn4430的解离区和来源于库斯塔克亚种大小为2062bp的小质粒复制区ori2062构建解离载体pBMB1125。将该载体电转化到苏云金芽胞杆菌中,解离载体pBMB1125在编码解离酶的帮助质粒pBMB1200作用下发生解离,消除抗性基因DNA片段,只留下目的基因以及苏云金芽胞杆菌质粒复制区的重组质粒,将解离后的菌株在无抗性培养基培养传代40代后仍可检测到解离后的重组质粒。 2.采用不同启动子、不同质粒复制区构建GFP表达解离载体 分别将带有芽胞依赖型启动子BtⅠ-BtⅡ、非芽胞依赖型启动子pro3A和蜡状芽胞杆菌启动子proB.c的gfp片段插入到以不同质粒复制区构建的解离载体pBMB1205,pBMB1206R以及pBMB1125上,得到9株以不同启动子、不同质粒复制区的表达GFP解离载体。将得到的9种GFP解离载体电转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中,荧光显微镜镜检显示9株含GFP的苏云金芽胞杆菌重组菌在波长为300nm-510nm的激发光下可发射绿色荧光。 3.建杀虫晶体基因与gfp基因的融合基因 PCR扩增全长gfp片段融合于去掉终止结构的杀虫晶体蛋白基因的C-端,构建融合基因。首先PCR扩增去掉终止结构的pro3A+cryⅠAc10片段,用BamHⅠ、SphⅠ酶切PCR产物插入到解离载体pBMB1205上得到中间载体pBMB1205Ac。同时扩增全长gfp片段,将扩增的gfp片段用SphⅠ消化插入到pUC19上得到pUC19G,再利用SphⅠ、BglⅡ双酶切消化pUC19G,回收两端酶切位点分别为SphⅠ、BglⅡ的gfp片段,将得到的gfp片段插入到pBMB1205Ac上最终得到重组的融合基因载体pBMB0474。将pBMB0474电转化到BMB171中得到苏云金芽胞杆菌重组菌,SDS-PAGE结果显示重组菌可以表达大小约150kDa-160kDa的GFP融合蛋白。 4.不同苏云金芽胞杆菌基因工程菌的微量热变化 利用生物活性检测器LKB-2277研究杀虫晶体蛋白含量不同的两株菌YBT-833、YBT-833-2-1的热动力学变化,发现菌体合成杀虫晶体蛋白的过程是一个耗能的过程,杀虫晶体蛋白产量高的菌株向外释放的代谢热少,反之亦然。研究含质粒拷贝数目分别为4、15的GFP菌株BMB304GFP、BMB315GFP的热动力学变化,发现质粒拷贝数目高的菌株向外释放的代谢热少,反之亦然。研究含不同质粒复制区构建的GFP解离载体的菌株BMB0452B、BMB0462B、BMB0472B的微量热变化,证明含小质粒复制区ori2062构建的 解离载体携带外源基因的菌株的代谢热少于以or汀草、oril哪口两种质粒复制区构建的GFP 解离载体。 研究还发现含不同启动子驱动GFP的菌株向外释放的代谢热也不同,含芽胞依赖型 启动子Bll-BtIJ的菌株BMB0462B的代谢热少于含非芽胞依赖型的启动子pro3A菌株 BMB0463B.含蜡状芽胞杆菌启动子proB.。的菌株BMB0461B的代谢热界于两者之间。根 据蛋白表达量同菌株代谢热的关系从9种GFP表达解离载体中筛选出一种高效表达GFP的 载体pBMB0472用以标记苏云金芽胞杆菌。 5.肺基因标记苏云金芽胞杆菌野生菌 将GFP解离载体pBMB0472以及融合蛋白载体pBMB0474分别电转化到拟步行甲亚 种YBT一1765中,得到标记的野生型苏云金芽胞杆菌YBT1765一72B、YBT1765一74。PCR扩 增结果显示均可从两株标记基因工程菌中得到肺片段,且还可以从YBTI 765一74中扩增出 犯T一1765中没有的c尽]A cjo基因。SDS一队GE结果显示标记野生菌YBT1765一72B可以表 达大小为27kDa的GFP,但YBT1765一74中检测不到融合蛋白的表达。荧光显微镜观察结 果表明YBT1765一72B在激发光下可以发射绿色荧光。


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