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甘蓝型油菜细胞核雄性不育的基因表达研究

贺华良  
【摘要】: 植物在生长发育过程中,很多基因都有其特有的表达模式,在不同的生长环境下,不同的组织或发育阶段,基因的表达水平都不一样。本文旨在通过对甘蓝型细胞核雄性不育材料与雄性可育材料的对照分析,用cDNA-AFLP差异显示法找出二者在花药临败育时期的差别表达基因,进一步研究差别育性基因对花药败育的影响;同时参考拟南芥中已发表的育性相关基因,根据保守同源序列设计引物在甘蓝型油菜中扩增同源基因,比较不育材料与可育材料序列之间的变异并做进一步的研究。本研究对隐性核不育材料S45进行了差异显示研究,获得以下主要结果: 1.建立了一套cDNA-AFLP差异表达分析的技术体系,并将cDNA-AFLP差异显示技术运用于油菜育性机理研究。研究表明cDNA-AFLP技术能够有效揭示核不育系的可育株与不育株的差异表达,具有稳定性好、重复性高等优点。 2.揭示了不育系中可育株与不育株的三种基因表达差异。采用三组引物512种引物对(2*16~2)进行AFLP扩增,分析表明,不同引物对扩增出的带纹数目不同,最多可达70多条,平均每对引物可扩增出约40条清楚的带纹。根据差异带纹的有无及强弱,可将其分成3类:(1)在细胞核雄性不育材料中没有而雄性可育材料中出现的差异带;(2)在细胞核雄性不育材料中有而雄性可育材料不出现的差异带;(3)雄性不育材料与雄性可育材料都出现但强弱不一致。这些丰富的多态性,对于分离与育性相关的基因和研究育性转变机理十分有用。 3.获得了22个大小在100-600bp的差异表达cDNA片段。通过筛选去除非特异性扩增的片段后有14个侯选差异表达cDNA片段,其中8个为雄性可育材料出现的差异带,另外6个雄性不育材料出现的差异带。 4.对14个候选差异表达cDNA片段进行了杂交筛选。14个差异片段经过反向Northern Blot鉴定和Northern Blot验证后,获得代号为1A-3、3B-2的两个阳性片段。对阳性片段克隆测序分析表明,1A—3片段含有与Doublesex- and mab-3相关转录因子家族的DM域(DNA-binding motif)高度同源的序列,DM域是转录因子调控动物精子发生的重要保守区域,推测油菜中含DM域的基因可能与花粉发育相关。3B-2片段的只在可育株中有Northern杂交信号,与拟南芥的一个未知功能基因高度同源,对此未知功能基因是否与败育相关需要进一步验证。 5.对油菜中与拟南芥MS1、MS2基因同源的基因进行了同源序列法研究。 华中农业大学硕士论文贺华良 扔及劲aP基因获得了全长序列,基因全长265Obp,mRNA长1928bp,含有7个内含子。 J献夕了勘aP基因目前只获得5’端1755bp,在1755bP序列中含有两个内含子。 6.对不育株和可育株的献笼肠,aP基因序列分析表明,不育株与可育株的 泌及知aP基因之间在五个位置上有单碱基差异,其中两个错义突变,三个无义突变。 不育株与可育株的献夕了BnaP基因在第一个内含子有一个碱基的差异。献夕了肠即、 J似笼肠,aP在不育株与可育株之间的差异以及与败育的可能相关性,需要进一步研究。


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