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红曲霉(Monascus spp)莫呐可啉K(Monacol in K)高产菌株的诱变选育及其发酵条件研究

胡晓清  
【摘要】: 从红曲样品中分离筛选得到一株Monacolin K产率较高(高效液相色谱法,HPLC)而桔霉素产率为0.11ng/g(酶联免疫吸附法,ELISA)的红曲霉菌株,编号为M12。以之为出发菌株,通过诱变筛选,获得一株Monacolin K产率有明显提高而桔霉素产率仅为0.13ng/g(ELISA)的突变株,编号为M12-69。对该突变株的液态和固态发酵条件进行初步优化研究。具体包括以下五个方面的内容: 第一,从红曲样品分离纯化获得红曲霉菌株25株,以这些菌株和从中科院购得4株红曲霉菌株,共29株作为菌种,制备得29个(固态)红曲样品。 第二,以上述29个红曲样品为实验材料,对红曲中桔霉素的(单向)薄层层析(STLC)条件进行了研究。结果显示,以甲苯:乙酸乙酯:甲酸(6:3:1)为展开剂,桔霉素的分离效果较好。按照该方法,对上述29个红曲样品中的桔霉素进行了分析测定,筛选得到6个桔霉素含量低于0.2μg/g的红曲样品及其相应菌株。 以上述6个低桔霉素含量的红曲样品为材料,对Monacolin K的双向薄层层析(DTLC)条件进行了研究。结果显示,以正己烷:乙酸乙酯:无水乙醚:甲酸(20:1:5:0.5)为第一展开剂,正己烷:氯仿:无水乙醚(30:1:5)为第二展开剂,Monacolin K的分离效果较好。以该方法对6个样品中的Monacolin K进行了分析测定,得到1个Monacolin K含量最高为225μg/g(DTLC)的红曲样品及其相应菌株。 为了更准确地判断该红曲样品桔霉素和Monacolin K含量,采用ELISA对桔霉素进行了分析测定,结果显示,该样品中桔霉素含量仅为0.11ng/g。同时,采用HPLC对Monacolin K进行了分析测定,Monacolin K含量为213μg/g。将该样品对应的菌株编号为M12。 通过上述研究,获得1株固态发酵产物Monacolin K产率为213μg/g(HPLC),桔霉素含量为0.11ng/g(ELISA)的红曲霉菌株M12。 第三,以M12为诱变出发菌株,采用紫外线、~(60)Co—γ射线、硫酸二乙酯 为诱变剂对其进行处理。突变株的桔霉素产率采用STLC分析,MonacolinK 采用DTLC分析,最后获得一株桔霉素产率低且MonacofinK产率有明显提高的突 变株M12一69。以M12一69为菌种制备(固态)红曲,其MonacolinK产率达2143协 9/9(HPLC),较出发菌株M12提高906.10%,而桔霉素产率仅为0.13 ng/g (ELISA),和M12相比,变化不大。 第四,根据Hawkswo曲和Pitt关于红曲霉的分类方法,对M12及M 12一69的培 养物进行了形态观察及分类鉴定。观察发现,M12一69与M12相比有较大的形态差别, 但二者均为丛毛红曲菌(物nascusPl’lo拟5 Sato)。 第五,对红曲霉突变菌株M12一69产MonacofinK的液态和固态发酵条件进行了 初步优化研究。 首先,研究了碳源、氮源、起始pH值、培养温度及时间等因素对M12一69液态发 酵的影响。结果显示,当培养基配方为:4%葡萄糖,0.4%谷氨酸钠,0.3%蛋白膝, 0.3%硝酸按,0.5%磷酸二氢钾,豆芽汁配制,起始pH值为5;培养条件为:25℃, 15or/min,摇床培养12天时,MonacolinK产率达275“g/而(D几C),桔霉素产率 为0.18n留ml(ELIsA)。在上述培养基和培养条件下,以14L模拟发酵罐进行扩大培 养,接种量为10%(v/v),通气量为6L/min,转速为200r/min,25℃,培养7天时, MonacolinK产率达280协9/1111(DTLC),此时桔霉素产率为o.20ng‘ml(ELISA)。 然后,研究了大米吸水量、培养温度及时间等因素对M12一69固态发酵的影响。 当固态发酵条件为:大米1009,鼓皮19,灭菌,趁热打散冷却后,添加20ml液体培 养基,摇匀,接种,25oC,培养18天时,MonaeolinK产率达2400;9/9(DTLC), 桔霉素产率仅为。.13n留g(ELISA),与国内外报道的MonacolinK高产菌株相比,以 M12一69制备的固态红曲中MonacolinK含量与报道的最高水平持平:


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