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链霉菌基因组中DNA大片段的基因置换与克隆

白林泉  
【摘要】: 链霉菌产生种类繁多的抗生素,而且抗生素生物合成的结构基因、调节基因和抗性基因往往成簇排列,因而许多抗生素生物合成基因簇十分庞大,也使得克隆和异源表达这些完整的基因簇异常困难。迄今为止,已经鉴定或克隆了50多个抗生素基因簇,其中许多基因簇大于40kb。链霉菌FR-008产生具有抗真菌活性的多烯类抗生素,其聚酮合酶(PKS)基因簇约为150kb,是研究大分子DNA克隆和异源表达的理想材料。本文对YAC和SCP2*这类承载能力较大的载体系统在克隆FR-008抗生素合成基因簇方面的利用进行了一系列载体改造和克隆策略方面的初步探索。 在载体构建之前,我们先在链霉菌FR-008中验证了基因置换方法的可行性。负责抗生素FRO-008合成的多数基因已经被克隆(Hu等,1994),但是目前还没有定位糖基合成基因以及与抗生素生物合成调节有关的基因。前期研究发现,包括pabAB基因及其上游区域在内的18kb片段的缺失导致FR-008合成能力的丧失。为了弄清在这个区域中是否含有糖基合成基因以及与调节有关的基因,我们构建了一系列分别置换该区域5.2kb+7.2kb+4.5kb、5.2kb-7.2kb、5.2kb和7.2kb酶切片段的基因置换结构pHZ670、pHZ679、pHZ674、pHZ675、pHZ676和pHZ677。将上述质粒通过改良的大肠杆菌-链霉菌双亲接合转移系统转入链霉菌FR-008,均获得了单交换发生的Thio~RAm~R衍生菌株,分别定名为BL10(FR-008∶∶pHZ670)、BL19(FR-008∶∶pHZ679)、BL14(FR-008∶∶pHZ675)、BL15(FR-008∶∶pHZ674)、BL16(FR-008∶∶pHZ676)和BL17(FR-008∶∶pHZ677)。在进一步筛选双交换菌株的过程中,我们分别在BL10和BL17的松弛培养物中得到了5.2kb+7.2kb或仅在7.2kb区域缺失的Thio~SAm~R菌株。在以啤酒酵母为指示菌的生物测定中,未观察到基因中断菌株BL14、BL15、BL16和BL17的产素表型的变化,而BL10、BL19以及所有的双交换菌株都丧失了产生FR-008的能力。尽管由于未知的原因尚未获得5.2kb区域的基因置换菌株,但是以上的试验证明基因置换过程是可以在链霉菌FR-008中进行的。 为了满足基因置换事件的发生以及被置换片段的回收同时发生的需要,我们将链霉菌低拷贝质粒SCP2*的双功能衍生载体pIJ903进行了改造。SCP2*可以在变铅青链霉菌等许可宿主内复制并在许可宿主间有效转移,但似乎不能够在链霉菌FR-008中复制,因此可能适合于在链霉菌FR-008中通过进行基因置换及随后的链霉菌FR-008和变铅青链霉菌间的接合过程来克隆完整的FR-008生物合成基因簇。在具有硫链丝菌素抗性基因的pIJ903的单一BamHI位点,同向插入了FR-008生物合成基因簇两个最远端的4.0kb和1.5kb片段,并在二者之间插入了可在链霉菌FR-008和变铅青链霉菌中表达的阿泊拉霉素抗性基因,同时也插入了有助于将质粒引入链霉菌的oriT片段,从而构建出了置换整个基因簇的基因置换质粒pHZ691。我们既可通过经oriT介导的大肠杆菌-链霉菌问的双亲接合转移过程,又可经过链霉菌间的接合过程而导入了链霉菌FR-008中。 SCP2*的应用有两个主要的限制,一是必须有被克隆基因簇的完整而详细的遗传学信息,二是要求它在被克隆基因簇的来源菌株中不能复制。为了在克隆完整基因簇时避免这两方面的影响并能随机地获得DNA大片段,我们将第二代YAC载体pJS97-pJS98改造成为适合于在 白林泉 链霉菌基因组中DNA大片段的基因置换与克隆 链霉菌中分析被克隆大片段功能的基因置换载体。在新载体系统PHz能1一pHz622中,我们不 但同向插入了来自于野生型变铅青链霉菌中HAu3R基因两侧的1 .4kb和1 .okb片段,而且还插 入了勿,七刃J和sPc心t厂抗性基因。预期在携带有大插入片段的基因置换YAC分子进入野生 型变铅青链霉菌后,YAC分子将通过1 .4kb或1 .okb片段与染色体发生同源单交换,继而发 生同源双交换,勿若.连同大插入片段一起稳定地整合到染色体上,而sPe尹/Str丢失,从而导 致菌株HygRstrS的表型。由于染色体上两个同源交换片段间的中HAu3R基因的缺失,发生双交 换的菌株变得对噬菌体小HAU3的感染敏感,同时也提供了一种富集阳性隆的反选择方法。为 了验证新型YAC载体系统的功能,我们将pHZ621~pHZ622进行了适当地改造,构建了质粒 pHZ625。与pHZ621一pHZ622相比,pHZ625保留了基因置换的基本结构和YAe的基本组份,但 缺失了一个pUC的复制子并在两个反向排列的端粒之间插入了2.Ikb的间隔序列。将PHZ625 除间隔序列以外的12.75kb线性部分转入变铅青链霉菌TK19,获得了六株HygRstrR的单交换 菌株BLI一BL6,转化具有环化染色体的变铅青链霉菌JN13也得到了以BL7和BLS为代表的 HygRstrn的单交换菌株。然而所有这些转化子还需要进一步通过杂交和高压脉冲电泳来确证。


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