玉米S组CMS胞质育性相关基因的克隆与结构分析

【摘要】： 细胞质雄性不育(CMS)是普遍存在于植物中的生物现象，研究其发生的机理有助于促进CMS材料在杂交种生产中的应用和了解线粒体的功能以及核质两套遗传系统相互作用规律。 用线粒体中常见的基因DNA作探针对Mo17和77两套核背景材料的N、T、C、S四种类型的胞质材料线粒体DNA进行了RFLP研究，发现在不同的胞质中大多数探针都检测到了丰富的多态性。通常在同一种胞质的材料中带型表现相同、而在不同组别中有差异。RFLP方法可用于玉米胞质的快速鉴定分类。同时，不同组别的带型差异反映了DNA水平的差异，有些差异为该组胞质所特有，这为寻找导致各种类型的CMS的基因提供了线索。 为了解决线粒体基因文库不易构建的难题，克隆S胞质的育性相关基因，本研究中摸索出了构建线粒体文库的新方法。由于采用低熔点琼脂糖包埋线粒体、原位消化、电泳分级、琼脂糖酶降解琼脂糖、BAC载体、电转化等新技术，成功构建了Mo17CMS-J线粒体基因文库。该技术体系的建立不仅有助于促进对玉米线粒体基因的研究，而且对其它植物材料的线粒体基因文库的构建也有较大的参考价值，因为其它植物分离大量线粒体和线粒体DNA更不容易。 所构建的Mo17CMS-J线粒体基因文库包含约2500个单菌落，来源于线粒体的克隆占总克隆数的63.6％，平均长度为18.24kb。如果线粒体基因组总长度以600kb计算，克隆子中外源DNA片段总长度覆盖线粒基因组的48倍，理论计算几乎能够以100％的概率克降到任何线粒体基因。重组DNA在继代过程中能稳定遗传，没有发现重排、嵌合、缺失等现象。用多个线粒体基因的DNA作探针筛选文库都找到了阳性克降。所以这是一个高质量的线粒体基因文库。对筛选到的克隆分析发现有两个重叠群，即S1或S2、COXⅠ、cob、5Srrn-18Srrn，这些基因在基因组中位置靠近：coxⅡ、R、atp6这三个基因在一起，这种形式的基因分布不同于已报道的NA、NB、CMS-T的基因组结构，可能是S胞质材料线粒体基因组在Mo17核背景下的一种的新的结构。 用人工合成的R区域特异引物从唐徐、WB两种S胞质的线粒体DNA中扩增出了R区域的一个1kb的片段，经DNA序列测定发现与CMS-S的R区的对应片段相比，有基本相同的碱基序例、相同的开放阅读框和基本相同的氨基酸顺序。以此DNA片段为探针从Mo17CMS-J线粒体基因文库中筛选出 了卜多个阳性克隆。从克隆B39中亚克隆了6.7kb的完整的BamHI酶切片段， DN八序列分析表明在R区内有数个开放阅读框orf，其中or们7中有丁三段)一补 列’J卜米线粒体aipg基因的编码区和3’侧翼有同源性，是‘个嵌合基因。 在6 .7kb)扩段的R区一{，.游的pNA序列包括有coxll从因，这种结构不同J’.已 报道的结构。研究了唐徐、双胞质R卜一域在儿种小叫核背景卜的农现，发现 有几种小同结构形式的R}沁域存在并以.核背景对这几种不同形式的R认域的 行;一附洲如还研究了M川7和77核背景下N、T·Q四种胞质玉米线粒体从 囚红!中R区存在情况，发现在C纤IC MS“一卜不存在R序列衬T组中可能只存 在川飞州吩片段·N、s’l’都存在R区似了J一结构一曰自价别，这反映了R区的 起源情况”还观察到了在M川7和77核背娥厂不同来源的S胞质材料有石书} 同的R区结构，井且这种R伏域的结构完个不同一j几前人的所报通的结构，是 利’新的R区结构形式。R区的内部的嵌合基囚。r 177可能是S组CMs的成 }从付沙来源s胞质材料珍拭内部之J’lU的微小差姗、R区在不同核背景卜结 构的变化、不同形式的R区量的变化可能足s组材料的各种育性不稳几定现象 的原I){Io