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苏云金芽胞杆菌解离载体的构建及其特性

吴岚  
【摘要】: 本论文主要围绕构建苏云金芽胞杆菌解离载体而开展研究工作,研究结果如下: 1.利用转座因子构建解离载体的可行性 利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离区构建了解离载体。将crylAc10基因或壮观霉素基因和苏云金芽胞杆菌的质粒复制起始区oril030连接在一起,置于两个同向的解离区之间,再将基因操作中所必需的大肠杆菌质粒复制起始区和抗生素标记基因等与之相连构成解离载体。该载体在转入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171时可先用抗生素标记筛选,随后在整合酶作用下体内重组,从而仅保留目的基因和苏云金芽胞杆菌质粒复制起始区。利用这种解离载体可有针对性的消除特定的DNA片段,有效解决基因工程菌构建中所面临的基因安全性问题。 2.整合酶对载体解离特性的影响 整合酶对解离载体的解离速率和时间影响很大。若在解离载体中引入整合酶基因,在大肠杆菌中无法筛选到转化子。缺失了3’末端终止密码子的整合酶基因在大肠杆菌中仍有功能,而在苏云金芽胞杆菌中功能极低。 3.解离载体的构建和性能 利用来源于不同质粒上的质粒复制起始区ori44和ori1030构建了4个解离载体。它们都能很好携带目的基因在苏云金芽胞杆菌中发生解离,仅留下包括目的基因和苏云金芽胞杆菌质粒复制起始区在内的重组质粒;在苏云金芽胞杆菌中能稳定遗传;对crylAc10和crylC基因的表达无明显差异;而且两载体间不存在质粒不相容性问题。它们的构建为今后构建高毒力基因工程菌提供了很好的材料。该类载体的构建在国内尚无人报道,国外也没有成熟的实用性好的解离载体的报道。 4.解离反应对杀虫晶体蛋白基因表达的影响 成功地利用解离载体将crylAc10,crylC和cry3A基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株,crylAc和crylC基因解离前后的表达量和杀虫毒力未见明显变化,cry3A基因在相同条件下则表达量有所提高,至于为何只对基因cry3A有作用尚不清楚,国内外也未见有人作相关报道。 5.cry3A启动子对基因表达的影响 利用解离载体将带cry3A启动子的crylAc10和crylC基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株,基因的表达和杀虫活性与带自身启动子的基因的表达相近。为避免因依赖相同σ因子造成杀虫晶体蛋白共表达的抑制提出了很好的改进思路。


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