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猪细小病毒基因组序列测定及结构蛋白基因的克隆、表达与基因免疫研究

赵俊龙  
【摘要】: 猪细小病毒病是由猪细小病毒引起的以初产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等为特征的猪的主要繁殖障碍性疾病之一。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行,严重地影响着养猪业的发展,因此一直是猪病研究的热点之一。本研究首先建立了用于猪细小病毒感染检测的PCR方法,在此基础上利用PCR技术扩增了猪细小病毒的近全基因组序列并与相关的毒株进行了比较和分析,分别克隆了结构蛋白基因VP_1和VP_2,进行了原核表达、真核表达以及基因免疫的研究。 根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了一对寡核苷酸引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段,回收该片段用EcoRI酶切得到了预期的结果,证实了该扩增片段的特异性。敏感性试验表明该方法可以检测出10~(-4)个TCID_(50)的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病料的检测,查出阳性16份,而同时利用HA检测阳性只有10份。这些结果说明本研究建立的PCR诊断方法具有灵敏度高、特异性强的特点。 以已经建立的PPV和PRV的单项PCR诊断方法为基础,通过对扩增条件的筛选,成功地建立了PPV和PRV的二联PCR诊断方法,并应用于临床,利用一次PCR反应,即可同时扩增PPV的445bp和PRV 217bp的特异性片段。该方法的建立对临床上进行这二种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。 以感染细胞中提取的RFDNA为模板,利用2次PCR反应扩增了包含猪细小病毒的近全基因组的DNA片段并进行了克隆和测序。将该序列在GenBank网站上利用DNA Blast软件进行比较发现该株病毒与GenBank收录的PPV基因组的核苷酸和氨基酸同源性均达到98%以上,证明了PPV基因组序列是十分保守的。从比较中可以看出,中国株PPV基因组的结构和已报道的PPV基因组的结构一致,即整个基因组由2个主要的开放阅读框架组成,5′端编码非结构蛋白NS_1、NS_2、NS_3,3′端编码结构蛋白VP_1、VP_2,整个编码区基因互相重叠,NS_2重叠在NS_1内,NS_3重叠在NS_1和VP_1内,VP_2重叠在VP_1内。 结构蛋白VP_1和VP_2是猪细小病毒的主要免疫原性蛋白。本研究利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP_1和VP_2全基因的2.5kb和2.0kb的基因片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体,利用双脱氧末端终止法测定了VP_1和VP_2全基因的核苷酸序列。将所得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较,同源性均在99%以上,从而说明这两种蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。 华中农业大学博士学位论文 将vPZ全基因分别克隆入原核表达载体pETzs(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成 表达质粒pET15bVpZ、pET17bVp:和pET28bvPZ;将含有VP:基因起始位点至o班 切点间的o.skb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bvPZfo利用上述四种 质粒转化大肠杆菌BLZ:,IPTG诱导后SDS一PAGE检测表达情况,结果发现 pET17bvPZf质粒在45kD处有一特异性表达带,而其它几种质粒均未看到特异性表 达带,推测VPZ基因3’端的某些结构可能对VPZ全基因的表达有一定影响。这一结 果对研究VPZ基因的结构与功能具有重要意义。 利用真核表达载体peDNA3 .1(+)和pChico分别构建了含有vPI基因的 pChieovPI和含有vPZ基因的pChieovPZ和PcDNAVPZ三种真核表达质粒。将上述 三种真核表达质粒分别转染IBRS一2细胞,利用间接ELISA检测表达情况,结果表 明上述三种质粒均能在IBRS一2细胞表达,表达产物位于细胞中。在此基础上,利用 这三种质粒分别以肌肉注射的方式间隔2周2次免疫小鼠,结果发现所有表达质粒 均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫,其中pCIneovP、质粒诱导的体液免疫最 强,和PPv灭活苗免疫组相当,pCIneovPZ诱导的细胞免疫反应强于PPv灭活苗组, PChieovP:和pChicoVP:联合免疫并没有加强作用。这一结果预示着PPv基因免疫 的良好前景。有关基因免疫诱导的免疫保护作用还有待进一步研究。 本研究中PPV PCR和二联PCR检测方法的建立解决了PPV持续感染和传代细 胞系PPV污染不易检测的难题,对猪细小病毒病的临床诊断、控制以及生物制品的 生产等均具有重要意义。中国株细小病毒全基因组序列的首次测定则为进一步研究 细小病毒的分子生物学打下了坚实的基础。结构蛋白基因的克隆、表达及基因免疫 的研究则对猪细小病毒病的免疫诊断、分子流行病学、免疫预防以及抗病育种研究 具有重大价值。


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