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猪伪狂犬病鉴别诊断方法的研究及单克隆抗体的制备

覃雅丽  
【摘要】: 伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由α疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病毒的天然宿主和贮存者。该病给养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制而最终根除该病我国当前面临的一项艰巨任务。在欧美等发达国家的伪狂犬病根除计划中,多采用gE缺失标记疫苗和相应的gE抗体鉴别诊断方法。同时gE糖蛋白也是PrV一种十分重要的糖蛋白,在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用。为了建立适合我国国情的gE鉴别诊断方法用于我国的伪狂犬病根除计划,以及制备用于病毒基因结构与功能和分子致病机理等方面研究的特异性的单克隆抗体,开展了以下研究。 1.PrV gE基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达 通过人工合成基因的方法对编码gE蛋白的第29~268位氨基酸残基的核苷酸序列(717bp)进行改造,用P.pastoris高表达蛋白偏爱的密码子替换原有的核苷酸序列,氨基酸序列保持不变。分四段分别合成,基因拼接得到了改造后的基因片段MgE717,经测序,除了在gE基因+763位核苷酸处存在一碱基置换,导致第255位的氨基酸残基由Asp(GAC)突变为Asn(AAC),其余的序列与PrV鄂A株gE基因的氨基酸序列相符。 将改造后的MgE717片段克隆至酵母表达载体α接合因子(α-MF)信号序列的下游,构建了重组表达载体pZα AMgE717,转化P.pastoris细胞SMD1168H之后,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选到gE蛋白表达量最高的一株重组酵母SAMgE717-6。但是SAMgE717-6表达蛋白不稳定从第3天开始降解,糖基化分析该表达蛋白发生了N-联糖基化。 以包含PrV鄂A株gE全基因的质粒pSDM1.78K+为模板,通过PCR的方法克隆了编码gE蛋白的第39~268位氨基酸残基的序列gE687,构建了酵母表达载体p9KgE687,转化P.pastoris GS115之后,再用G418筛选,得到一个多拷贝表达菌株G17。Western-blot分析显示G17的表达产物的大小为35kD,用糖苷酶PNGase F消化后分子量没有变化。 为了在同等条件下比较密码子偏爱性对gE表达量的影响,将未经改造的gE序列gE687构建成表达载体pZαBgE687,同时以改造后的序列MgE717为模板通过PCR的方法扩增同样编码39~268位氨基酸残基的片段MgE687,构建了表达载体pZαAMgE687。分别转化酵母细胞SMD1168H,通过ELISA筛选,得到两个抗原量高的重组酵母SBgE687-7和SAMgE687-4。但是SBgE687-7的诱导上清经SDS-PAGE和Westem-blot分析,未观察到特异性的表达带,而SAMgE687-4有特异性的表达蛋白带,并且表达蛋白发生了N-联糖基化。说明采用酵母偏爱的密码子可以提高gE在P.pastoirs中的表达量。 华中农业大学博士研究生论文 2.gE抗体鉴别诊断方法(gE一ELISA)的建立 利用酵母表达的gE蛋白为抗原建立了gE抗体鉴别诊断方法(gE一ELISA)方法, 用方阵滴定确定了最佳包被浓度为1.67p留mL,血清最佳稀释倍数为1:40。通过检测 64份PrV阴性的血清,确定该方法的阳性判定标准。特异性、重复性和对比试验结果 表明,该方法特异性强、重复性好,用gE一ELISA与进口的gPI抗体检测试剂盒对比检 测2个猪场的447份lflJ.清,总符合率为90.8%,检测结果基木符合,证明gE一ELIsA可 用于伪狂犬病病毒gE抗体的检测。该方法的建立为我国早日实施伪狂犬病的根除计划 提供了有力的技术支持。 3.抗PrV和I,rV gE糖蛋白单克隆抗体的制备 用纯化的PrV为免疫原,通过杂交瘤技术得到两株分泌抗Pry单克隆抗体(McAb) 的杂交瘤细胞,分别命名为6A6Hll和6H3F5。染色体数目分析证明为杂交产物,免疫 荧光试验证明两种单抗特异性地与PrV反应,用小鼠腹水生产的McAb的ELISA效价 分别为l:looxZ’4和1:100x2’“。这两种单克隆抗体可以为开展Pry鄂A株的基因结 构与功能、Pry与细胞间相互作用、病毒抗原的诊断等方面的研究提供特异性的检测手 段。 用酵母表达的gE主要抗原为免疫原,通过杂交瘤技术得到三株分泌抗Pry gE蛋白 的杂交瘤细胞S6DS,G36E4和G21B2,染色体计1数证明为杂交产物,免疫荧光试验证 明三株均为gE蛋白特异性的抗体,用小鼠腹水生产的McAb ELlsA效价分别为1:100 XZ’0、l:100XZ’3和l:100x2”。这三种抗gE的单抗为今后开发阻断ELIsA方法检测 猪血清中的gE抗体以及研究gE的功能等方面奠定了基础。 4.抗氯霉素单克隆抗体的制备 氯霉素(CAP)在动物源食品中的残留问题不仅危害着人民的身体健康,也影响了 我国的动物源食品的出口贸易。为了建立一种有效的检测CAP残留的ELISA方法,用 人工合成的氯霉素一人血清白蛋白(CAP一HSA)为免疫原,通过杂交瘤技术建立了一株 分泌抗CAP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞1 Fg。经检测,杂交瘤染色体数目84一% 条,其分泌的抗体亚类为IgG,,间接ELlsA检测细胞培养上清效价为l:256,诱生腹水 抗体效价可达1:6x 105,竞争间接酶联免疫吸附测验(c iELIsA)显示与供试抗生素及 结构相关化合物交叉反应小。该单抗可用于建立氯霉素残留检测的ELISA方法。


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