绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达与应用

【摘要】：本文围绕绿色荧光蛋白基因在苏云金芽胞杆菌中的表达及应用，从以下几个方面进行了研究，取得结果如下： 1．绿色荧光蛋白基因gfp在苏云金芽胞杆菌中表达的初探 将携带蜡状芽胞杆菌特异启动子的gfpmut3α基因克隆到穿梭载体pHT304后，电转化至苏云金芽胞杆菌BMB171，CryB，IPS78-11，4Q7，HD-80-21中。通过荧光显微镜和Bio-assay Reader对含重组质粒pGFP-304的5个受体菌分别进行荧光检测及定量分析。结果表明，gfpmut3α基因仅在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171，CryB，IPS78-11，4Q7中表达并可检测得到菌体发光，并建立了一套适合于苏云金芽胞杆菌的gfp标记与检测方法。 2．利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性 绿色荧光蛋白基因gfp分别标记苏云金芽胞杆菌的cry3A启动子P_(cry3A)，BtⅠ-BtⅡ启动子P_(BtⅠ-BtⅡ)和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P_(44-12)以研究其表达差异。其中，P_(cry3A)和P_(BtⅠ-BtⅡ)分别与gfp构成融合基因，以调控gfp在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP-304(含P_(44-12))、pGFPExpA(含P_(cry3A)-gfp融合基因)和pGFPExpB(含P_(BtⅠ-BtⅡ)-gfp融合基因)分别导入大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌后发现，P_(44-12)和P_(BtⅠ-BtⅡ)在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfp，其中P_(BtⅠ-BtⅡ)在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而P_(cry3A)不能启动gfp在大肠杆菌中表达，在苏云金芽胞杆菌中启动的gfp表达的荧光强度也较弱。 3．携带不同启动子苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的微量热学变化 生物活性检测器对含重组质粒pGFP-304，pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明，3种启动子驱动下的gfp基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P_(44-12)和P(BtⅠ-BtⅡ)启动gfp表达的代谢热低于P_(cry3A)驱动gfp表达的代谢热。 4．苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的构建 本研究利用SOE法将构建的绿色荧光蛋白基因gfp和苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry1Ac10的嵌合基因克隆到穿梭载体pAD4412上获得成重组质粒pBMBZGC10。同时又将苏云金芽胞杆菌启动子P_(BtⅠ-BtⅡ)替换蜡状芽胞杆菌启动子P_(4412)，经同一穿梭载体pAD4412构建得到了pBMBZGC11。再通过电转化法 将它们导入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171和cryB中获得重组菌株 BMB171(PBMBZGC10);CryB(pBMBZGC10);BMB171(PBMBZGCll)和CryB (P BMBzGcll)。经荧光显微镜观察标记重组菌株仅能在标记重组菌株 BMB171(pBMBzoelO)和CryB(pBMBZGClo)中检测到嵌合基因的表达; SDS一PAGE结果也显示了融合蛋白约为1 50 kDa大小的蛋白带型。 5.苏云金芽胞杆菌标记重组菌株的荧光检测分析 本研究分别利用Leiea Stereo MZFlll型荧光显微镜、Leiea Di叩lan型荧光显 微镜和Zeiss Axioplan型激光共聚焦扫描显微镜，对苏云金芽胞杆菌标记重组菌 株的菌落、菌液、菌体分别进行荧光检测。ZeisS荧光显微镜激发光波长为488nm、 发射光波长为522nm(oF32)。并用Laser sharp Z000TM专用软件对收集到的图形 信号进行捕获和处理。近一步用Bio一assay Reader对标记重组菌株进行荧光强度 的检测，选择激发滤光片为485二、发射滤光片为52Onm。用HT Soft 2.0软件 分析所得数据。 6.帮助蛋白P20对苏云金芽胞杆菌标一记重组菌株影响的研究 将携带有pZ口基因的穿梭载体pBMBZO一2，利用电转化的方法分别导入苏云 金芽胞杆菌标记重组菌株BMB 1 71(pBMBZGClo)和CryB(pBMBZGClo)得到 BMB 1 71(pBMBZGC 10一20)和CryB(pBMBZGC 10一20)。经普通光学显微镜和荧光 显微镜观察尸2口基因对融合基因表达的影响。结果发现重组菌株BMB 171 (pBMBZGC 10一20)和CryB(pBMBZGCIO一20)能够检测到很强的绿色荧光。进一步 通过荧光强度分析表明，20 kDa帮助蛋白能够增加融合蛋白的表达量。 7.苏云金芽胞杆菌标一记重组菌株与杀虫基因水平转移的研究 将重组菌株CryB(pBMBZGC 10)的发酵液按浓度梯度分次进行喷洒小白菜 (Brassica夕exinesis)、雍菜(IP000ea啊uatiea)和番茄(勿c叩ersicon esculentum) 作为供试植株，利用标一记基因研究的结果表明:cry了Aojo基因没有向供试土壤细 菌、真菌和放线菌转移，也未在植物的供试植物根、茎和叶中检测到该基因。