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根癌农杆菌介导的ACC氧化酶基因转化香石竹的研究

余义勋  
【摘要】:香石竹(Dianthus caryophyllus L.)是世界四大切花之一,在花卉市场中占有重要地位。延长瓶插寿命对延长观赏期和调节流通有重要作用。传统的保鲜方法多采用乙烯抑制剂或乙烯拮抗剂的保鲜剂,但这些化学物质多会造成环境污染,且成本较高。本研究通过克隆香石竹ACC氧化酶(ACO)基因,将其构建成不同T-DNA结构的植物表达载体,并导入香石竹不同品种,分析转基因香石竹切花的瓶插寿命。 1 ACO基因的克隆及其植物表达载体的构建 根据已发表的香石竹ACO基因序列,设计一对特异引物,以香石竹品种‘America’基因组DNA为模板,扩增出香石竹ACO基因,将其连接到pMD18-T质粒载体上,对序列测定结果与已发表的ACO基因cDNA序列进行对比分析显示,该克隆片段含3个外显子,2个内含子,外显子序列与已发表的ACO基因cDNA序列完全一致。通过中间载体pBluescript SK和pIC19R,经PCR分析及酶切检测,成功地构建了ACO基因正义、反义、正义重复和反义重复等4种不同T-DNA结构的植物表达载体,并用冻融法将该4种植物表达载体导入了农杆菌LBA4404菌株。 2 香石竹5个品种再生体系的建立 采用香石竹无菌苗叶片为外植体,建立了香石竹5个品种‘Aicardi’、‘Master’、‘Yellow Star’、‘Opera’和‘Mabel’的再生体系。幼叶比老叶分化率高,叶片在含BA和TDZ两种细胞分裂素中都可以分化,但在含TDZ培养基中,不定芽玻璃化程度较高,且发现AgNO_3(0-25 mmol/L)对不定芽分化起抑制作用,因此选用MS+NAA 0.3mg/L+BA 1.0mg/L为分化培养基,5个品种的再生率在38.6%与61.8%之间。无菌苗茎段在R1(MS+NAA 0.1mg/L)、R2(MS+IBA 0.1mg/L)和R3(MS+IAA 0.1mg/L)三种培养基中均能生根,但以R1培养基生根率最高(100%)。无菌苗生根后经炼苗移栽至河沙、珍珠岩和腐叶土的3种基质中,结果表明在珍珠岩中的成活率(78.7%)明显高于河沙和腐叶土。 3 香石竹5个品种的遗传转化 用农杆菌介导法对上述5个品种进行了遗传转化。实验表明:香石竹对潮霉素比较敏感,叶片分化选择压力为4-5mg/L。在转化过程中对预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度以及共培养时间等转化条件进行了摸索。将香石竹叶片在分化培养基上预培养2天,于根癌农杆菌菌液(OD_(600)值为0.6-0.9)侵染8-12min,在含100mmol/L的乙酰丁香酮的培养基上共培养3d,转移到选择培养基(MS+NAA 0.3mg/L+BA 1.0mg/L+Hyg 4mg/L+Cef 400mg/L)中培养,剔除 华中农业大学博士学位毕业论文 选择培养前两周分化出的腋芽,每3周换一次培养基。在此期间,抗性芽长至1 cm 时切下转移到选择生根培养基(MS+NAA 0.1 mg/L十Hyg 4.0 mg几)中生根培养。 不同品种抗性芽分化率在4.3%和11 .2%之间, 4转基因植株的获得及检测 比较四种提取香石竹基因组DNA的方法,其中改良SDS法所提DNA较纯, 且拖带较少。抗性不定芽在选择生根培养基上生根率为48.3%,PCR扩增HPT基因 表明,24.5%的抗性生根植株为阳性。Southem杂交证实,14.2%的抗性生根植株外 源基因已整合到植物基因组中。共得到33株转化株系,其中30株为单拷贝,3株 为两个拷贝。 5不同T一DNA结构导入后对香石竹瓶插寿命及乙烯释放量的影响 分析了4种T一DNA结构导入‘Master’、‘Mabel’和‘Yellow Star’3个香石竹 品种17个转化株系瓶插寿命及部分株系乙烯释放量的测定结果。 在转化‘Master’品种正义ACO基因的3株转化株系中,有l株瓶插寿命显著 延长;在转化反义ACO基因的4株转化株系中,3株瓶插寿命显著延长;在转化正 义重复ACO基因的2株转化株系瓶插寿命显著延长,抑制乙烯生成达90%以上;在 转化反义重复ACO基因的3株转化株系中,瓶插寿命都显著延长,延长的时间较长 (达12d以上),而且抑制乙烯生成达100%。 以上结果表明,4种结构的T一DNA均能在一定程度上抑制内源基因的表达,相 比之下,反义强于正义,重复基因结构强于单一基因结构。 6转化同一T一DNA结构不同品种间的瓶插寿命比较。 在转化‘Master’品种的n株系中有8株瓶插寿命得以显著延长,在转化Mabel’ 品种的3株系中有l株瓶插寿命得以显著延长,在转化‘Yelfow Star’只有1株, 其瓶插寿命得以显著延长。 转化同一T-DNA结构不同品种间的瓶插寿命有一定差异。在转化正义ACO基 因的‘Master’品种3株系中有1株系瓶插寿命得以显著延长,‘Mabel’品种2株系 瓶插寿命都未延长;在转化反义ACO基因的‘Master’品种的4株系中有3株系延 长,‘Yellowst盯’品种1转化株系瓶插寿命延长;在转化正义重复ACO基因的 ‘Master’品种的2株系瓶插寿命均达12d左右,‘Mabel’品种2株系有1株系瓶 插寿命延长。 另在同一株系的不同花朵之间瓶插寿命也存在着差异,可能是转化嵌合体所致。


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