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银杏酚酸的分离纯化及其生物活性研究

倪学文  
【摘要】:银杏酚酸是银杏叶提取物中的限量因子,在银杏外种皮中含量最高,其独特的药理和毒理活性日益受到人们的广泛关注,但与银杏叶相比,银杏酚酸的研究还很少。本文旨在利用现代色谱分离理论和分析鉴定技术,建立银杏酚酸高效准确的定量和分析方法;对从银杏外种皮中分离纯化银杏酚酸的工艺条件进行系统的研究,并对其结构进行鉴定:探讨银杏酚酸对细菌和病原真菌的抑制作用;利用免疫学和细胞生物学的实验方法,从免疫调节、细胞凋亡等角度探讨银杏酚酸抗肿瘤的机理。其主要研究结果如下: 1 银杏酚酸的反相高效液相色谱测定方法研究 根据银杏酚酸结构和性质的差异,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离银杏酚酸,对流动相组成、pH值和柱温各种影响因素进行了研究,得到银杏酚酸的RP-HPLC分析条件为:色谱柱为SUPELCOSIL~(TM)LC-18(15cm×4.6mm,5μm);流动相为90%甲醇,乙酸调pH值为3.15;紫外检测波长λ=310nm;流速为0.7ml/min;柱温为30℃;灵敏度AUFS=0.02。在确定的色谱条件下,银杏酚酸的峰高分离度R_h均大于1,银杏酚酸各组分的容量因子均在3~8之间。 在银杏酚酸高效液相色谱分离理论的基础上,建立了银杏酚酸HPLC的定量测定方法,运用二极管阵列检测器分析了样品中银杏酚酸色谱峰和对照品的色谱峰,结果表明二者各对应色谱峰的紫外光谱完全相同,定量分析中所确定的色谱峰是正确的。样品用甲醇浸提、过滤后可直接进行HPLC分析,平均回收率为97.02%,相对标准偏差RSD(n=5)为1.28%,线性范围在0.498~8.879μg,线性相关系数为0.9998,最低检测限为7.2ng。银杏酚酸的高效液相色谱定量测定方法简便、快速、灵敏、准确,可用于银杏产品的质量监控。 2 银杏酚酸的提取工艺、纯化和结构鉴定 对从银杏外种皮中提取银杏酚酸的工艺进行优化,得到银杏酚酸的优化提取条件为:以80%乙醇为提取溶剂,采用1:7(W/V)的料液比,在60℃条件下回流提取3次,每次4h,此条件下银杏酚酸浸出率为8.021%。利用大孔吸附树脂进行分离富集银杏酚酸,对银杏酚酸在树脂上的吸附、解吸特性和吸附动力学行为进行了研究。得到银杏酚酸分离纯化的工艺流程为:银杏外种皮采用1:7的料液比,用80%乙醇在60℃条件下回流提取3次,每次4h,提取液经抽滤浓缩后,经过D4020吸附树脂纯化(水,65%,90%乙醇梯度洗脱),洗脱液浓缩后用S_1溶剂萃取,再浓缩,冷冻干燥,再经AB-8吸附树脂纯化(75%乙醇和95%乙醇梯度洗脱),冷冻干燥后得 银杏酚酸的分离纯化及其生物活性研究 燥后得到淡黄色银杏酚酸,产物纯度为95%,得率为0.89%。 通过对从银杏外种皮中纯化得到的银杏酚酸进行定性实验,紫外、红外光谱分 析,二极管阵列检测器检测和反相高效液相色谱一电喷雾电离质谱伍SI一Ms)联用分 析,证实了纯化得到的银杏酚酸为C13:0,C15:1,C17:2,C15:O和C17:1,其相 对百分组成为12.0:41.77:4.89:3.52:37.83。 3银杏酚酸的抑菌活性研究 采用常量肉汤稀释法,研究了银杏酚酸对细菌和病原真菌的抑制作用。银杏外 种皮水提取物、乙醇提取物和纯化的银杏酚酸都有很好的抑制细菌和植物病原菌的 活性,且随着银杏酚酸含量增加,抑菌活性增强,可见银杏酚酸是其中主要的抑菌 活性物质。银杏酚酸主要表现为抑制革兰氏阳性菌,对蜡状芽抱杆菌、枯草芽抱杆 菌和金黄色葡萄球菌等有很好的抑制作用,而对大肠杆菌等革兰氏阴性菌几乎没有 抑制作用,同时表明银杏酚酸的烷基侧链在抑菌中起了关键作用. 4银杏酚酸抗肿瘤作用及机理研究 银杏酚酸浓度为10,20,40m叭gd时,对小鼠S:。。肉瘤的抑制率分别为38,93%, 42.90%和62.94%,40m叭gd的抑瘤率超过了阳性对照药物cy。银杏酚酸使荷瘤小 鼠的胸腺重量减轻,但无明显差异,中低剂盘组能显著提高荷瘤小鼠脾脏的重量, 但高剂量组却减轻脾脏重量;银杏酚酸能明显增强DNFB诱导的迟发型超敏反应, 显著增强荷瘤小鼠脾细胞抗体生成能力,且能明显提高荷瘤小鼠血清lgG溶血素的 含量。说明银杏酚酸对荷瘤小鼠有免疫调节的作用,提高荷瘤小鼠的细胞免疫和体 液免疫能力,对免疫功能的影响有一个最佳剂量范围,可通过提高机体免疫功能来 抑制肿瘤。 银杏酚酸能降低荷瘤小鼠血清乳酸脱氢酶的活性,但只有高剂量组表现出显著 性差异;能显著提高荷瘤小鼠红细胞过氧化氢酶活性,提示银杏酚酸的体内抗移植 性肿瘤的活性可能是通过改变一些酶的活性来实现的。 5银杏酚酸诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的研究 银杏酚酸能剂量依赖性地显著抑制人宫颈癌hela细胞增殖,经银杏酚酸作用后 的hela细胞在倒置和荧光显微镜下可见凋亡的形态学特征改变,DNA琼脂糖凝胶电 泳可见明显的DNA梯状条带,单细胞电泳可见明显DNA断片拖尾,原位末端标记 检测为阳性,流式细胞仪分析图上出现典型的凋亡细胞峰,细胞周期分析表明银杏 酚酸主要是影响hela细胞S期向GZ舰期的转变过程,将细胞阻滞在S期,减少进 入GZ八吐期的细胞数量,减少其有丝分裂,引起细胞凋亡。当银杏酚酸浓度为1.5、 6、12、24mg/L时,细胞凋亡率分别为10.07%、30.69%、49.64%和5


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