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棉花体细胞胚胎发生的调控及其抗病虫基因的遗传转化

吴家和  
【摘要】:棉花是重要的经济作物,然而棉花受病虫的危害严重,每年造成皮棉产量损失达到总产的10%-20%。利用遗传工程技术改良棉花品种能够提高棉花的种植效率。然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍,如棉花体细胞胚胎发生的基因型依赖性、棉花组织培养的低效性(耗时,耗工)、基因转化技术的复杂性(难重复,转化率低)和转基因棉花的农艺性状的变异等等,这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。本研究内容主要涉及棉花体细胞胚胎发生的调控,高效棉花遗传转化体系的建立;转化获得双抗虫基因和双抗病基因的棉花;同时对转基因引起的棉花性状变异的规律进行初步研究,为转基因棉花育种提供理论指导。取得的主要研究结果如下: 1 IBA的浓度对棉花愈伤组织的诱导和体细胞胚胎分化起着至关重要的作用,在和KT配合使用下能使珂字201品种的愈伤组织的胚胎分化率提高到89.5%:实验结果表明诱导棉花愈伤组织和体细胞胚胎分化的最优化激素配比分别为:IBA1.0mg/L+KT0.5mg/L和IBA0.5mg/L+KT0.3mg/L。 2 在诱导愈伤组织培养基中补加120mg/L硫酸镁,珂字201愈伤组织的诱导量和增殖量都相应的增加到最大值;而在增殖培养基中增加42mg/L硫酸亚铁,会使愈伤组织的生长受到抑制,但是改良了愈伤组织的质量,加速向胚性愈伤组织转化。在分化培养基中补加1.0g/L的氯化钾可以促进愈伤组织分化成胚;补加200mg/L的氯化钙也可以促使愈伤组织向胚分化,但是会抑制胚性愈伤组织的生长。在诱导原始愈伤组织时,诱导培养基中NH_4NO_3的水平对愈伤组织以后能否发生体细胞胚胎分化至关重要;在分化培养基中撤去NH_4NO_3,并增加KNO_3,可以明显提高愈伤组织胚分化率,使珂字201的愈伤组织胚分化率达到80%以上。在体细胞胚成熟和萌发培养基中增加2.0g/L谷氨酰胺和1.0g/L天门冬酰胺,能促进王可字201体细胞胚的成熟和萌发。 3 在上述的基础上建立棉花体细胞胚胎发生的植株再生体系,利用该体系使许多再生顽拗的品种成功获得体细胞胚胎发生和植株再生,这些品种主要有Ekang 3、Ekang 4、Ekang 6、Ekang 8、Ekang 9、Ekang 10、Emian 22、Ejing 1、B1和B11。并比较了咳体系的再生效率,它比现在大多数实验室通用的两种棉花再生体系(2,4-D+KT和NAA+2ip)所适用的品种基因型范围广,所建立的再生体系的体细胞胚胎分化率为:81.7%,而其它两个体系的胚胎分化率为21.8%和43.5%。 4 棉花组织培养和体细胞胚胎发生的整个过程存在着两次不同程度的愈伤组织褐化,其内存的原因可能是愈伤组织发生了细胞程序性死亡。对棉花不同时期的愈伤组织DNA进行琼脂糖电泳,愈伤组织的DNA里存在着180bp左右的片断为 单位的DNA梯度电泳。在这两次PCD高峰后一周均出现愈伤组织大规模的褐化 死亡。对体细胞)J4:胎分化时期的愈伤组织进行染色,显微镜下观察发现发生细胞 程序性死亡的细胞核浓缩、染色质凝聚、结块、边缘化和形成凋亡小体;其细胞 质(包括核)被液泡挤压,呈半月形收缩,在细胞程序性死亡发生过程中,往往 也伴随有巨型细胞生出“芽泡”的现象。 预培养12天的棉花胚性愈伤组织是较好遗传转化材料,对转化的影响因子进行 比较实验,结果表明利用OD值为0.3的农杆菌菌液,用TMGL或LB培养基进 行重悬或稀释菌液用作侵染菌液,在23℃下,暗培养48小时左右,用100 mg/L 的一卡那霉素进行选择,500 mg几的头袍霉素抑制农杆菌的生长。利用这些优化 参数使坷字201的胚性愈伤组织转化率达到72.5%。 利用农杆菌介导棉花胚性愈伤组织把双抗虫基因,。少了Ac和A尸I-B,转入坷字 201棉花品种中,经卡那霉素涂抹、PCR扩增、Southern杂交和叶片离体喂虫证 实,所获得转双抗虫基因棉花的抗虫性达到92.8%一98.7%,比对照BR98一2(仅 O,jA。基因)的抗虫性显著。 利用农杆菌介导棉花胚性愈伤组织把双抗病基因一几丁质酶基因和葡聚糖酶基 因转入冀合321棉花品种中,经卡那霉素涂抹、PCR扩增、Southern杂交、苗期 鉴定和大田调查证实,所获得转双抗病基因棉花的部分株系为高抗黄萎病,病情 指数为6.5一9.5,比对照冀合321(52.4)的抗病性显著。 建立的棉花胚性愈伤组织作外植体的农杆菌转化体系,相对于大多数用下胚轴作 外植体的转化体系来说,有其显著的特点;首先,从愈伤组织直接选择、分化体 细胞胚和再生出转基因植株仅需要6个月,比其它方法缩短了3一5个月;其次, 使一些体细胞胚胎分化能力小的品种遗传转化成为可能,并增加了棉花组织培养 的预见性;再次,有很高的转化效率,在较短的时间里可获得大量的转基因植株。 棉花转基因后代存在着大量的体细胞克隆变异,几乎涉及到各个农艺性状;对 500个转基因变异群体进行初步的研究表明,农艺性状的变异有一定的规律性。 皱缩叶片的突变体经遗传分析和分子杂交证实为外源基因在棉花体内发生重排。 双抗虫基因在棉花体内的的遗传比较复杂。


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