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伪狂犬病毒Ea株gD基因转基因细胞系的构建及其人工感染仔猪的病理学

石德时  
【摘要】:伪狂犬病(Pseudorabies or Aujeszky's Disease)是危害世界养猪业的最重要的传染病之一。目前,一些发达国家实施根除计划根除该病,而在发展中国家,该病仍然频繁发生,严重制约了这些国家和地区养殖业的发展。本研究着眼于伪狂病发病机理的进一探索及新型基因缺失疫苗的开发利用,主要研究工作及研究结果如下: 1.转gD基因细胞系的建立 本研究分别采用真核表达质粒介导的方法与逆转录病毒介导的方法,将PrV Ea株gD基因导入PK-15细胞中,建立起2株表达gD的细胞系PK~(PD)与PK~D,并对其相关生物学特性进行了详细的研究。通过免疫荧光观察,发现导入的gD基因在这2株细胞系中均获得表达,表达产物gD定位在细胞膜上,呈现明显的极性分布,并具备原有的免疫反应性。在相同培养条件下,PK~(PD)与PK~D的细胞形态、生长速度与正常PK-15细胞无明显差异,表明转入的gD基因对细胞的生理活动无不良影响;每隔5代,用PCR技术和间接免疫荧光染色法分别对PK~(PD)和PK~D进行检测,一直检测到第30代,两者仍能检测到gD基因和其表达产物,表明该转入PK~(PD)与PK~D中的gD基因具有良好的遗传稳定性,不同的是:转入PK~D的gD基因由于整合进细胞的染色体中遗传稳定性更佳,在传代过程中无基因丢失现象,而转入PK~(PD)中的gD基因,由于存在于真核质粒中,在传代过程中有逐渐稀释的现象。用PK~D细胞作宿主细胞,用脂质体介导的方法,将PrV Ea株基因组分别转染PK~(PD)与PK~D细胞,结果两者在转染后30h左右细胞发生典型病变,表明PK~(PD)与PK~D细胞对脂质体的毒害具有耐受性,可用作构建重组病毒的转染细胞。TCID_(50)测定结果表明:PK~(PD)与PK~D细胞系对表型阳性PrV增殖有明显抑制作用,但不妨碍PrV的正常增殖;这个结果既进一步佐证了PK~(PD)与PK~D细胞系确实表达了gD,从而在一定程度上屏蔽了位于PK~D细胞上的gD受体,使PrV毒株对宿主细胞的吸附受到影响,削弱了其感染性;又证明了gD的表达并没有严重抑制PrV的增殖,这为日后利用PK~(PD)与PK~D筛选gD基因缺失毒株提供了依据,即PK~D细胞系既能补救gD基因缺失毒株的gD表型,又使具备了这种表型的毒株能在其上顺利实现增殖,这两个方面结合起来,构成了在PK~(PD)与PK~D细胞系上筛选gD基因缺失毒株的充分必要条件。 以上研究结果表明细胞系PK~(PD)与PK~D都可用于PrV Ea株gD基因缺失毒株的构建及其大量增殖,为构建一种高度生物学与生态安全的新型PrV基因缺失毒株—gD基因缺失毒株提供了良好的技术平台。 2.PrV Ea株gD基因缺失毒株的构建 首先构建gD基因缺失的转移质粒SK-gG-2.4,将转移质粒SK-gG-2.4、p6.6BEII与伪狂病毒Ea株TK~-/gE~-/LacZ~+突变株基因组分别共转染PK~D,用空斑技术和PCR技术筛选重组病毒,纯化得到两株重组病毒TK~-/gD~-/gE~-、TK~-/gD~-/gE~-B。PCR扩 华中农业大学博士学位论文 增片断酶切分析及测序结果表明:转移载体上的外源片断确实重组到病毒的基因组 中,按常规,原有的gD基因应该被置换下来,得到gD基因缺失的重组病毒,但 将重组病毒分别接种在PK一15、BHK、Hela、IBRS一2等正常细胞上并传代,发现 两者在这些细胞上传代后仍能增殖,传代前后的病毒增殖滴度无明显差异,在非互 补细胞系上的增殖滴度与亲本毒株无明显差异。上述实验结果表明,本研究得到的 2株重组病毒在非互补细胞系上也能实现正常增殖,这一研究结果与国外报道的 Pry gD基因缺失突变株的生物学特性有很大差异。 为弄清楚这种差异的原因,对重组病毒是否仍然存在gD基因的问题进行了研 究。结果发现重组病毒中仍然存在gD基因,且位于其原来的位置,表明重组病 毒发生重组的部位不在预计的部位而发生在其它部位。 分析比较转移质粒与亲本毒株基因组上可能的其它同源臂,将目标锁定在 Lacz基因上,对亲本毒株TK’/gE几acZ+的LacZ表达盒的方向进行鉴定,结合重 组病毒PCR扩增片段测序结果,发现得到的重组病毒系由亲本毒株的LacZ表达盒 上游与转移质粒上的LacZ基因a片段(451一626bP)形成另一个同源臂进行同源交换 所致。 令人费解的是:由LacZ表达盒引入的整个TK7gE一/L acZ+基因组上唯一的 EcoRI识别位点,是位于LacZ表达盒的尾部,在构建重组病毒时,己用EcoRI将 TK一/gE’/L acZ十基因组切成2段,如果以转移质粒上的LacZ基因a片段(451一626bP) 作另一同源臂进行同源交换,则转移质粒与TK一/gE一/L acZ+基因组的两个同源臂都 位于其中的同一段上,按常规得到重组病毒的几率很小,而本试验却意外地得到2 株这种重组病毒,而且其中TK一/gD一/gE一第一代的阳性率就高达95%,这其中的原 因有待进一步研究。但sK质粒上的Lacz基因a片断(451一626bP)可作为同源臂进 行同源交换的发现,既为重组病毒构建时的技术路线设计及转移质粒的选择提供了 借鉴,也为重组病毒的构建、外源基因的引入提供了新的途径。 为得到真正的gD基因缺失毒株,本研究接着构建出了gD基因缺失的转移质 粒psKKs,为以伪狂犬病毒TK-/gG一/L acZ+(其中的Lacz表达盒是正向插入的) 作亲本毒株构建gD基因缺失毒株奠定了基础。 3.PrV Ea株人工感染


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