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高效甘蓝型油菜遗传转化体系的建立及细胞周期基因的花粉特异表达分析

潘刚  
【摘要】:甘蓝型油菜是我国乃至世界最重要的经济作物之一。传统常规育种技术在油菜重要经济性状的遗传改良中起到重要作用,但随着生产需求对品种要求的日益提高,常规育种技术的局限性也日显突出。因此采用新技术将新的基因资源引入油菜十分必要。利用农杆菌介导的遗传转化引入外源基因为油菜产量、品质、抗性和其它性状的遗传改良提供了新途径,该技术也是现代生物学研究中了解特定基因功能与表达模式不可缺少的手段。但现有农杆菌介导的冬油菜转化程序还存在着严重基因型依赖性和转化周期长等问题,因而限制了该技术的广泛应用。细胞周期基因是一类对植物生长发育有重要影响的功能基因,但它们对植物花粉发育形成的影响还很少研究。 本研究以甘蓝型冬性和半冬性油菜为主要材料,研究了影响冬性和半冬性油菜子叶外植体芽再生和遗传转化的因素;利用优化的遗传转化体系,将拟南芥的细胞周期基因导入春油菜Westar中,研究了细胞周期基因对油菜花粉发育和形态发生的影响;此外,建立了一种利用超声波分离油菜、小麦等花粉细胞核的新方法,借助流式细胞仪对野生型和转细胞周期基因的油菜花粉细胞核进行了DNA含量分析。获得的主要结果如下: 1 通过对培养基、激素配比、预培养时间、蔗糖浓度等影响油菜子叶外植体芽再生因素的优化筛选,建立了适合于冬性和半冬性油菜子叶的优化再生体系。将子叶在附加1 mg/L BA和1 mg/L 2,4-D的MSB5培养基中预培养3天,再转入含有4.5 mg/L BA的MMO培养基中培养,可显著增加芽再生率,并且可将再生周期比对照缩短1/3。在这一条件下10个冬性和半冬性油菜品种的平均再生率达80.82%,其中9个品种的芽再生率均在75%以上,最高可达98.89%。 2 在业已建立的高效快速再生体系的基础上,通过优化预培养和共培养时间,采用合适的选择压,建立了适用于冬性和半冬性油菜的子叶高效快速遗传转化体系。利用这一体系对8个品种进行遗传转化测试,结果遗传转化效率均在12.09%以上,最高的可以达到28.29%。PCR和DNA杂交分析证明了转基因的整合及拷贝数的分布。同时,通过对预培养基的激素配比、MES、对无菌幼苗进行4℃低温处理等因素进行优化,降低了下胚轴褐化率,从而初步建立了适合于冬性和半冬性油菜下胚轴的遗传转化体系。 3 通过对超声波处理时间、分离花粉培养基等因素的研究,利用超声波破碎花粉壁法,成功地分离到比较纯的油菜单核、二核和三核期花粉细胞核。这些核可用于流式细胞仪DNA含量分析和高纯度的核DNA制备。利用此法,分离的花 华中农业大学博士学位论文2004 粉细胞核,并用流式细胞仪测定了两个物种不同时期的花粉细胞核的DNA含 量。首次探测到油菜成熟花粉群体中存在Zn花粉核。 4利用农杆菌介导的遗传转化方法,将花药特异启动子控制下的细胞周期基因导 入春油菜Westar中。并对周期蛋白基因CycDZ转基因后代的花粉发育进行了详 细分析。结果显示:(l)由于周期蛋白基因的表达,导致花粉形态由对照的具 3个萌发孔的花粉变成2个或多个萌发孔的花粉:(2)在转基因的花粉形成过 程中,除了正常的4分体外,还出现了5分体、6分体以及7分体,从而导致 成熟花粉的数目增加;(3)对不同株系的成熟花粉进行了DNA测定,发现有 些株系花粉中ZC DNA含量明显增加。 关键词:甘蓝型油菜;农杆菌介导的遗传转化;预培养;细胞周期基因;CycDZ; 超声波;Zn花粉;流式细胞仪


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