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阿维菌素有效组分的定点改造

朱浩君  
【摘要】:阿维菌素(avermectin)是一组含有8个组分(B1a、B2a、B1b、B2b、A1a、A2a、A1b和A2b)的大环内酯类衍生物。其中avermectin B1a的生物活性最强。本研究通过基因置换技术定位中断了avermectin无效组分的合成途径以获得有效组分,其中的关键酶基因为C5 O-甲基转移酶基因和α-支链酮酸脱氢酶基因。 C5 O-甲基转移酶基因(aveD)位于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体的3.4kb BamHI片段上,本研究先构建Avermectin基因组约3.4kb BamHI片段的亚基因文库,用PCR扩增获得该基因的连锁基因C5—酮基还原酶基因(aveF),并将其作为探针筛出aveD的克隆子pAD1101。测序后与GenBank做同源比较,确证为该基因。 将1.7kb安普霉素抗性基因aprA插入aveD的NruI位点,得pDA1118。然后将aveD亚克隆到pHZ1358,得基因置换穿梭载体pHJ5803(pHZ1358::aveD::aprA),并通过ET12567::pUZ8002属间接合转移导入S.avermitilis Bjbm9903。放松培养后筛选出双交换重组菌株Bjbm0006,并用PCR的方法验证重组菌株的aveD已经破坏。从重组菌株摇瓶发酵液中提取avermectin进行色谱质谱联机分析,发现重组菌株仅产生4个组分,与出发菌株的4个B组分完全一致。 以Avermectin B组分菌株S.avermitilis Bjbm0006为出发菌株,用PCR的方法分别构建α-支链酮酸脱氢酶基因bkdABC和bkdFGH(branched-chain α-keto acid dehydrogenase)的基因中断载体pHJ5821(pHZ1358::bkdABC::erm)和pHJ5816(pHZ1358::bkdABC::erm),并对其进行基因中断,分别得到重组菌株Bjbm5821和Bjbm5816。其中Bjbm5821发酵产物除了产生B1a和B2a外,还有一种新的化合物;而Bjbm5816发酵产物只含有单一组分新的化合物。 这一新组分经过精制结晶后溶于氘代丙酮,通过质谱分析,1H-NMR、13C-NMR和二维NMR,证实该化合物为oligomycinA。根据oligomycinA和avermectin糖苷配基的结构推出oligomycinA的合成途径。在生物活性检测中发现该化合物对黑曲霉(Aspergillus niger)、肉桂紫正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)和高渗散囊菌(Eurotium tonophilus)等丝状真菌有明显抑制作用,对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)微效,对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和其他供试细菌无效,对小菜蛾(Plutella xylostella)的室外抑制作用优于avermectin,对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和红蜘蛛(Tetranychus viennensis)的抑制作用与avermectin相同。 对重组菌Bjbm0006、Bjbm5821和Bjbm5816的发酵工艺研究结果表明,3个重组菌的代谢特性与原始菌株基本相同。Bjbm5821的发酵水平较低,约300单位,avermectin的代谢途径被部分阻塞;而bjbm5816的avermectin代谢途径被完全阻 博士论文:阿维菌紊有效组分的定点改造 断,只产生单一的01190卿cinA·


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