收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

肠道病毒71型基因组研究和SARS冠状病毒结构蛋白的鉴定与分析

周世力  
【摘要】:本文对肠道病毒71型(SHZH03毒株)进行了全基因组序列测定,利用巴斯德毕赤酵母系统表达了肠道病毒71型外壳蛋白VP2,对SARS冠状病毒的核蛋白(N)和突起子糖蛋白(S)进行了鉴定与分析,研究结果如下: 1.肠道病毒71型(SHZH03毒株)全基因组序列测定 对肠道病毒71型(entetovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03基因组建立了覆盖全基因组的8个首尾重叠的克隆,并在此基础上对全基因组(未包括多聚腺苷酸尾)的7406个碱基进行了核苷酸序列的测定和分析。结果表明,SHZH03株基因组具有典型的肠道病毒71型的基因组结构,在编码区没有核苷酸的缺失和插入;在5'UTR和3'UTR区,SHZH03在核苷酸序列和长度上和其它EV71有差异,存在缺失和插入。核苷酸同源性比较结果表明,在P1区,SHZH03株与台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高,为87.9~92.5%;与新加坡流行株SIN5666、SIN5865以及标准株MS和BrCr的同源性则为80.4~82.3%,而与Coxsakievirus A16的同源性最低,为63.6%。氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Coxsakievirus A16的同源性最低(79.8%),但在P2和P3区,SHZH03株与Coxsakievirus A16的同源性最高(98.3%和96.8%)。P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和台湾98年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远。外壳蛋白基因VP1的遗传进化分析表明,SHZH03和SHZH98以及台湾1998年EV71流行时的8个毒株属于同一组(cluster)。这些结果提示了我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年的EV71大规模流行时的毒株,对于我国EV71的基因分型、分子流行病学研究、EV71流行规律和疾病的治疗与预防都有借鉴意义。 2.肠道病毒71型外壳蛋白VP2在巴斯德毕赤酵母中的表达 从细胞培养物中提取EV71病毒基因组RNA,再利用RT-PCR技术,扩增出EV71外壳蛋白基因VP2,连接于T载体,经测序证实目的基因VP2的序列正确;构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实α-factor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,经SacI酶切使之线性化,用电转化法将目的基因转化并整合到宿主菌GS115基因组中;经G418加压筛选多拷贝整合菌株、转化子表型筛选和PCR分析鉴定后以及甲醇诱导,在Pichia pastoris酵母中实现了VP2的高效分泌性表达。经饱和硫酸胺分级沉淀法初步纯化后,重组蛋白VP2的纯度可达90%以上。SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子量为27kD,与天然VP2大小相近。Western blot分析和ELISA实验表明,Pichia pastoris酵母表达的重组蛋白VP2具有免疫学活性,为研发快速、灵敏的诊断试剂和安全、高效的基因工程亚单位疫苗打下了良好的基础。 3.SARS冠状病毒的核蛋白(N)和突起子糖蛋白(s)的鉴定与分析 从广东分离了确诊为非典型肺炎死亡病例的尸解标本,利用293细胞系进行扩 增,待细胞出现典型的CPE后,收集细胞并分离病毒,利用蔗糖密度梯度超速离心 方法纯化病毒颗粒。经sDS一PAGE电泳分离,银染或考马斯亮蓝染色,在凝胶上 出现大量非常明显的条带。将所有的侯选条带从凝胶中切下,T卿sin降解,质谱(LCQ DEcAxP咖Protcomex Worksfation)分析,证实47KD左右条带为sARs一Cov病毒 颗粒的核(N)蛋白带;巧OKD:附近条带为SARS一cov病毒颗粒的s糖蛋白带。所 获得的SARs冠状病毒核蛋白的质谱分析数据覆盖了所预测病毒核蛋白氨基酸序列 的98%(第一次质谱分析数据的覆盖率为87%,第二次质谱分析数据的覆盖率为 76%)。从而首次从蛋白质水平对sARS冠状病毒核蛋白进行了证实。所获得的s蛋 白氨基酸序列的质谱分析数握占所预测S蛋白氨基酸序列的百分比较低,仅为47%, 但在我们获得的一系列二级质谱碎片的氨基酸序列与SARS一Cov基因组所预测S蛋 白质的序列完全吻合,从而在蛋白质水平对sARS冠状病毒的S蛋白及其序列进行 了证实。我们在分析S蛋白质谱数据时,发现了一些SARS冠状病毒膜蛋白(M)的 氨基酸序列,提示sARs冠状病毒存在s蛋白和M蛋白的相互作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;我国科学家成功解析SARS冠状病毒进化规律[J];口岸卫生控制;2004年01期
2 万佳,郝运伟,姜颖,贺福初;SARS冠状病毒的分子生物学研究[J];生命的化学;2004年05期
3 刘伟,李振勇,屈凌波;32株SARS冠状病毒基因组比对在PCR检测中的应用(英文)[J];生物信息学;2004年01期
4 谭晓东,侯炜;SARS相关的科技新术语[J];科技术语研究;2003年03期
5 张传海,王一飞,张美英,戚树源;SARS及其病原体研究进展[J];生命科学;2003年03期
6 陈志南,徐静;SARS冠状病毒的研究现状[J];第四军医大学学报;2003年11期
7 木易;SARS冠状病毒的稳定性和抵抗力[J];中华医学信息导报;2003年10期
8 晏辉钧,赵卫,方丹云,周经姣,龙北国,张文炳,郭辉玉,江丽芳;SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达[J];中国病毒学;2005年01期
9 苏山;SARS幕后的故事[J];大自然探索;2003年07期
10 石磊,张其鹏,芮伟,卢铭,景霞,尚彤,国强华;SARS冠状病毒推定结构蛋白序列分析[J];北京大学学报(医学版);2003年S1期
11 鲍琳琳,涂新明,蒋虹,佟巍,丛喆,魏强,朱华,张扬清,高虹,邓巍,黄澜,刘亚莉,王健伟,秦川;SARS冠状病毒分离培养和鉴定的实验研究[J];病毒学报;2005年01期
12 高洁,李静,娄晋宁;SARS冠状病毒的研究进展[J];中日友好医院学报;2005年03期
13 杨新艳,徐军,钟南山;SARS冠状病毒的分子生物学研究进展[J];国外医学.呼吸系统分册;2005年01期
14 尹卫国,吴移谋,谭立志,肖建华,杨秋林,张文波,曾桥,万艳平;SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定[J];中国人兽共患病杂志;2005年03期
15 阎锡蕴,张锦彬;重症急性呼吸系统综合症的研究现状与展望[J];生物物理学报;2003年02期
16 孙浩,杜奇石,王树青,谢军民,李大鹏;SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用[J];湘潭大学自然科学学报;2004年04期
17 周旭;SARS冠状病毒分子病毒学特性研究概况[J];微生物学免疫学进展;2003年04期
18 安丽萍,王笑英,曾常茜,杜培革,金莹;SARS冠状病毒核衣壳蛋白cDNA的克隆和原核表达载体的构建[J];北华大学学报(自然科学版);2004年04期
19 孙啸,谢建明,周士新,谢雪英,陆祖宏;SARS病毒与其他冠状病毒的基因组比较[J];中国病毒学;2003年04期
20 孙诤;SARS冠状病毒的基因组结构与药物治疗[J];科技情报开发与经济;2004年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 冯金磊;王波;牛国君;郭宇;陈卫强;杨诚;饶子和;;具有SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的秦艽有效成分研究[A];中国化学会第28届学术年会第3分会场摘要集[C];2012年
2 何诚;朱虹;雷鸣;何君;檀华;左庭婷;杨琪;端青;;新分离人呼肠病毒和SARS-冠状病毒感染小鼠病理学变化及发病机制[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年
3 朱关福;;严重急性呼吸综合征(SARS)问题的探讨[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
4 甘燕;吴少庭;秦莉;潘晖榕;戴五星;袁仕善;黄达娜;;SARS冠状病毒E蛋白DNA疫苗的构建及其实验免疫研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
5 李策生;张爱华;林连珍;李星;刘俊生;杨晓明;;有机溶剂/表面活性剂灭活血浆中的SARS冠状病毒的研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
6 杨松涛;夏咸柱;乔军;高玉伟;阎芳;谢之景;赵忠鹏;黄耕;;SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达与初步应用[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
7 刘忠华;程树军;郭中敏;曲利芝;魏社林;顾为望;黄韧;;实验动物和公园动物中SARS病原来源调查初报[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年
8 马超楠;徐军;;SARS冠状病毒Spike蛋白预处理对LPS介导的炎症反应的影响[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
9 王红霞;孟庆文;刘永刚;施建忠;孔宪刚;冉多良;吴东来;;SARS冠状病毒未知蛋白5的原核表达[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
10 潘晖榕;吴少庭;戴五星;雷明军;袁仕善;秦莉;黄达娜;张仁利;高世同;;SARS冠状病毒E蛋白的表达与纯化[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周世力;肠道病毒71型基因组研究和SARS冠状病毒结构蛋白的鉴定与分析[D];华中农业大学;2004年
2 王翠娥;SARS病原体鉴定、动物模型建立及灭活疫苗保护效果的病理学研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
3 鲁小璐;SARS冠状病毒N蛋白抑制beta干扰素产生的分子机制研究[D];武汉大学;2010年
4 刘树春;SARS冠状病毒基因组及其编码结构蛋白的生物信息学研究[D];中国医科大学;2004年
5 杨宁;甲型H1N1流感病毒诱导呼吸道上皮细胞凋亡机理研究及PI4KB调控SARS冠状病毒细胞进入机理研究[D];北京协和医学院;2012年
6 赵琪;冠状病毒复制酶系结构与功能研究[D];清华大学;2010年
7 王宝梅;SARS冠状病毒S蛋白HLA-A~*0201限制性CD8~+T淋巴细胞表位的鉴定[D];第二军医大学;2004年
8 张嘉杰;SARS冠状病毒S蛋白抗原表位多肽的设计、合成及其免疫反应[D];第一军医大学;2004年
9 石嵘;SARS冠状病毒检测寡核苷酸基因芯片的研制及应用[D];第一军医大学;2004年
10 刘利锋;严重急性呼吸综合征(SARS)康复者长期的体液免疫记忆反应[D];北京协和医学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 许寅超;SARS冠状病毒N抗原蛋白表达及血清抗体检测方法研究[D];第一军医大学;2004年
2 张强;SARS冠状病毒核蛋白的原核表达及初步应用的研究[D];山西医科大学;2004年
3 胡日查;SARS冠状病毒木瓜样蛋白酶生物学功能研究[D];内蒙古农业大学;2010年
4 张玲;蝙蝠ACE2与SARS-CoV S蛋白相互作用的关键氨基酸鉴别[D];黑龙江大学;2010年
5 谢燕丕;重庆地区儿童人类冠状病毒流行情况[D];重庆医科大学;2010年
6 郑洋;SARS冠状病毒木瓜样蛋白酶对IRF3信号通路的调节机制[D];北京工业大学;2012年
7 杨宇东;SARS冠状病毒PLpro蛋白酶的生物学功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
8 王晓佳;SARS冠状病毒S糖蛋白基因的克隆表达[D];吉林大学;2008年
9 栾翔凌;SARS病毒E、M、N基因克隆、表达及免疫原性初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
10 马超楠;SARS冠状病毒Spike蛋白预处理对细菌内毒素介导的肺细胞炎症反应的影响[D];广州医学院;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 艾启平 王怀民;科研人员发现SARS冠状病毒致命点[N];大众科技报;2009年
2 本报记者 倪永华;为攻克SARS而奋斗[N];科技日报;2003年
3 邹声文 周婷玉;非典病毒感染可能与ACE2有关[N];医药经济报;2005年
4 姜广策;SARS原凶“另有其人”[N];医药经济报;2003年
5 本报记者 谭勇;“中国干扰素之父”谈SARS软肋[N];医药经济报;2003年
6 记者 韩晓玲 通讯员 王怀民 杨雪;武大攻关SARS冠状病毒研究[N];湖北日报;2009年
7 江南;抗SARS药物找到了[N];人民日报;2005年
8 ;SARS:从未见过的冠状病毒[N];中华工商时报;2003年
9 林子;人类与病毒之战永无宁日?[N];中国商报;2003年
10 王育琨;SARS惊醒灵性的回归[N];中国经营报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978