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利用Tn5401转座子构建解离载体并在苏云金芽胞杆菌中高效、稳定表达AiiA蛋白

吴怀光  
【摘要】:苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白,能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子(AHLs)。AiiA蛋白在苏云金芽胞杆菌各亚种中广泛存在,但表达量低,对N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子的降解活力不高:同时由于AiiA蛋白是一种非分泌型蛋白,致使它无法与环境中的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子直接发生作用,限制了其降解活性的发挥。 S层(Surface layer)是位于细胞外壳最外层的一类表面结构,生物圈中有S层的生物体普遍存在,尤其在占细菌和真细菌中,S层是最常见的表面结构之一。这层结构对细菌细胞的生存及完整性有着很重要的作用。S层是由蛋白质或糖蛋白亚基组成的单分子晶体点阵,它们形成有孔的网格结构覆盖在细胞表面。利用S—层蛋白可以进行细胞表面展示,将目的蛋白或多肽带到胞外并锚定在细胞表面,而保持原有目的蛋白的生物活性。 苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白基因的启动子是一类强启动子,其启动表达的S-层蛋白可形成晶格状覆盖在细胞表面,S-层蛋白N末端的信号肽和S-层同源模体(S-layer homology motif,SLH)可用作细胞表面展示载体。本研究试图利用苏云金芽胞杆菌CTC菌株S-层蛋白基因的启动子来增强AiiA蛋白的表达,并利用S-层蛋白表面展示功能将AiiA胞内蛋白带到胞外并锚定在细胞表面,以与环境中的AHLs分子直接作用,提高其降解活性。 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子,它相对其它cry基因的启动子有启动基因转录时间早,持续时间长的优点,在构建苏云金芽胞杆菌基因工程菌时常被采用。本研究采用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子柬增强aiiA基因在细胞内的表达,并对比上述两种表达方式对AiiA蛋白降解AHLs分子活力的影响。 在构建苏云金芽胞杆菌工程菌中,利用转座子构建的解离载体能消除质粒上的抗性基因和非苏云金芽胞杆菌片段,使得重组菌中的质粒能够在无抗性选择压力下稳定遗传,以提高重组菌的稳定性。Tn4430转座子广泛存在于除以色列亚种以外的苏云会芽胞杆菌各亚种中,这给基于Tn4430转座子构建的解离载体转化苏云金芽胞杆菌库氏塔克亚种(B.thuringiensis subsp.kurstaki)野生菌带来很大困难。本研究选用来自于莫里逊亚种(subsp.morrisoni)的转座子Tn540l上解离酶识别的特征序列(Interdal Resolucion Sequence,IRS)构建解离载体pBMB5401,以此为操作平台研究两种不同AiiA的表达方式及其组合对AiiA蛋白降解N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子活性的影响,这两种不同表达方式是:利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达AiiA蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来增强aiiA基因的表达。 本研究利用解离载体pBMB5401构建并得到三个不含抗性基因的重组菌BMBcaiiAR, 阴B:lait服和日MB3439尺,‘己们依次含有对力二,l’l’J和Pl~o,期习了l’.A融合基因,以及它们的 组合对/7二,j1’]爪户1一队势}、:‘川。结果表明融合蛋白北H一八iiA及pro:3八一Ai以在解离后的重 组菌中均得到表达,融合蛋白跳j谨一Aii‘、的表达不影啊pr心A一Ai讯的表达,SLH一A工以 蛋白和pr(): 3A一‘\11气蛋白在同一工程菌中表达对、HL、分子的降解活性并不产生拮抗作 用。本研究还比较了三个谊组菌BMBc抓i:\R,3MB;3aiiAR和BMB3439R对AHLs分子的降 解活性以及对胡萝卜软腐欧文氏菌致病性的抑制效果,研究结果表明同时利用杀虫晶体 蛋白基因。吸1,’,,l.]:,启动子和苏云金芽胞杆菌5一层蛋白基因况c的启动子对。,j州基因进 行改造获得的工程菌BMB洲39尺抗软腐病效果比3MB3a认A尺和BMBctlii银好:当SLH一A认.气 蛋白和蛋白pr韶A一Ai讯表达量相当的时候,重组菌BMBCai iAR比BMB;3缸iAR更能有效 阻止胡萝卜软腐欧文氏菌感染对马铃薯的侵染,表明利用S一层蛋白把A主1.:\蛋白带到胞 外并锚定在细胞表面有利护其与AHLS分子直接发生作用,更进一步提高降解活性。


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