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口蹄疫病毒VP1基因C末端及猪α/β干扰素在大肠杆菌中的表达研究

彭贵青  
【摘要】:口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害世界各国畜牧业最严重的疾病之一,其病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)。预防和控制口蹄疫关键是疫苗和诊断方法。目前用于口蹄疫的诊断技术有多种,但ELISA是一种最经济、有效的方法之一。而传统ELISA需要全病毒作为抗原或制备抗体,生产全病毒需要昂贵的培养基,且存在散毒的危险。一种可供替代的方法就是将型特异性序列进行体外表达,用表达产物作为检测用抗原。此外,目前研究发现α/β干扰素对口蹄疫有很好的抗病毒效果。本研究拟从以下两个方面进行: 1.口蹄疫病毒VP1基因C末端串连表达及其抗体ELISA方法的初步建立 参照Taiwanse97(AJ294928)设计了一对特异性引物,从pcDNA-P1中克隆出VP1基因C末端,包括B细胞表位(141-160aa)和T细胞表位(200-213aa)。序列分析表明:其C末端长285bp,编码74个氨基酸,与O/HKN/12/91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源性分别为95%、93%和96%、93%;利用同尾酶Xho Ⅰ、Sal Ⅰ将VP1基因C末端串联起来;再将单拷贝和双拷贝C末端基因插入到原核表达载体pGEX-KG后,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得表达,经Western blotting检测证实表达产物具有活性。以表达产物包被ELISA板,初步建立了特异、敏感的ELISA诊断方法。同时用表达产物免疫BABL/c小鼠,能产生一定的抗O型口蹄疫病毒的抗体。该研究将在研制新型疫苗和建立诊断方法等方面具有潜在的理论价值和应用前景。 2.梅山猪α/β干扰素的克隆、定点诱变及原核表达 利用PCR技术从中国梅山猪白细胞总DNA中扩增出α/β干扰素基因(MS-IFNα/β),将PCR产物克隆至pMD18-T载体,利用双脱氧末端终止法测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明:β干扰素基因全长561bp,编码186个氨基酸,与GenBank中S41178的序列同源性达到99%,在128、177位核苷酸处发生了点变异,由G变为A,T变为C;但仅导致43位氨基酸由G变为E;猪干扰素(MS-IFNα)全长570bp,编码189个氨基酸的前体蛋白,其中含23个氨基酸的信号肽和166个氨基酸的成熟多肽,成熟多肽中含5个半胱氨酸,与GenBank中M28623的序列同源性为96%。通过巨引物法,分别对MS-IFNα基因(第86位氨基酸)和MS-IFNβ基因(第17位氨基酸)进行定点诱变。在此基础上,通过PCR方法将编码成熟蛋白基因亚克隆到PGEX-KG表达载体,转化宿主菌BL_(21)(DE_3),经IPTG诱导后,得到高效表达,其表达的蛋白质大小约47kd。表达产物主要为不溶性的包涵体,包涵体经提取纯化后,能够抑制FMDV增殖。该研究为今后进一步探讨猪干扰素在抗病毒活性以及作为治疗病毒性急性感染药物的研究奠定基础。


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