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柑桔衰退病毒的快速检测技术研究

余冬冬  
【摘要】:由柑桔衰退病毒(Citrus Tristeza Virus,CTV)引起的柑桔衰退病是世界性的柑桔病害,对柑桔产业造成了严重威胁,巴西等南美国家曾一度因此病危害而使柑桔产业濒临崩溃。在我国浙江、四川、广西等一些柑桔产区,柚子和甜橙普遍受到衰退病毒的侵染而表现茎陷点症状。开展CTV的快速检测研究对其防治具有极为重要的作用。为建立和优化CTV检测方法,提出柑桔样品中CTV的检测技术流程,本研究采用生物学、组织学、免疫学和分子生物学检测方法,对HB柚、PG杂柑、GL橙、AW橙、鱼橙、霜橙、本地早、林娜脐橙8个品种进行了检测分析,并对各种检测方法的优缺点进行了比较。 利用墨西哥来檬、酸橙、杜肯葡萄柚和Madam vinous甜橙作为指示植物检测鉴定CTV分离物TR-L514及分离自本地早和林娜脐橙的分离物。3种分离物接种到指示植物后都产生了典型症状,分别被初步判断为苗黄株系、茎陷点株系和弱毒株系。指示植物的病叶叶柄和主脉徒手切片,经苯胺蓝染色后,在韧皮部组织内观察到紫色的病毒内含体,薄壁组织和木质部均不着色。 用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)检测HB柚、PG杂柑、GL橙、AW橙、鱼橙、霜橙、本地早、林娜脐橙8个品种的春梢、夏梢和秋梢。林娜脐橙、AW橙和鱼橙3个品种为阳性,但春稍和秋梢的P/N值要明显高于夏梢。用生物素—亲和素系统ELISA(BAS-ELISA)检测以上8个品种的秋梢,林娜脐橙、AW橙、鱼橙、霜橙和本地早5个品种为阳性。以枝皮和嫩叶作检测材料效果良好,以老叶作检测材料,不管是什么品种,还是春梢、秋梢、夏梢,均检测不出CTV。组织印迹法检测鱼橙、AW橙、林娜脐橙和GL橙4个品种,其枝条横切面印迹均染上紫色,颜色的深浅与ELISA检测的P/N值成正比。通过印迹可以直观看出CTV在韧皮部内分布不均匀,枝条顶端的病毒含量要高于末端。 提取本地早、霜橙、TR-L514,林娜脐橙、鱼橙和AW橙6个样品的dsRNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。6个样品带型相近,都有A、B、D、E四条带,但是本地早和霜橙的E带比较模糊。除了TR-L514外,其它5个品种还有C带。TR-L514、林娜脐橙、鱼橙和AW橙在C带和D带之间还有一条比较模糊的带。dsRNA分析虽然可以检测CTV,但dsRNA的带型与分离物的生物学特征并不相关,表明dsRNA用来鉴定CTV株系不准确。 提取柑桔叶片总RNA作为模板进行一步法RT-PCR检测以上8个样品的春梢和夏梢,林娜脐橙、本地早、鱼橙、AW橙和霜橙5个品种的春梢和夏梢均为阳性。HB柚的春梢检测为阳性,但夏梢为阴性。同一品种其夏梢扩增的目标片段的亮度远没有春稍高,进一步说明CTV随着气温的升高在柑桔组织内的含量急剧下降。 IC,RT.pCR检测以上8个样品的秋梢,林娜脐橙、AW橙、鱼橙、霜橙和本地 早5个品种为阳性。分别用IC.RT.PCR和TC一RT.PCR检测林娜脐橙、AW橙、鱼 橙3个品种的夏梢,两种方法均扩增出354如的目标片段。但对于同一材料, TC.RT.PCR扩增目标带的亮度不如IC.RT一CR。IC Nested RT.PCR检测霜橙、本地 早、HB抽3个品种的秋梢,均得到明亮的354bP目标带。IC一RT一PCR检测为阴性 的HB袖在此次检测中为阳性。 以粗提纯的病毒作SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳,然后将蛋白质转移到PVDF膜 上进行westem blot。林娜脐橙和TR.L514蛋白质带型相近,SDS.PAGE出现四条蛋 白质带,但仅有一种25KDa的蛋白质与CTV多克隆抗体Bari反应。25KDa蛋白质 推断为Cl,V的衣壳蛋白。 通过比较以上各种检测方法的优缺点,我们认为TAS一USA或组织印迹可作为 标准的血清学检测方法:免疫捕捉RT.PCR或巢式PCR可作为标准的分子生物学检 测方法。在此基础上,我们总结出综合运用生物学、血清学和分子生物学方法检测 CTV的流程图。


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