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农杆菌介导的Chi和Glu基因转化黄瓜的研究

张国广  
【摘要】:黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科黄瓜属的蔬菜作物,在国内乃至世界范围内栽培面积较大。真菌病害的发生给黄瓜生产带来巨大的损失,制约了黄瓜的产量和品质的提高。 植物基因工程的快速发展为抗性育种提供了一条崭新而有效的方法。来源于菜豆的几丁质酶基因(chitinase gene,Chi),其蛋白质产物能够降解含几丁质的真菌细胞壁,抑制真菌生长。克隆自烟草的β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene,Glu)产物β-1,3-葡聚糖酶能够降解许多真菌菌丝暴露在表面的β-1,3-葡聚糖,从而抑制真菌的生长。 本实验建立了稳定的黄瓜再生、转化体系,并将Chi基因和Glu基因导入3个基因型的黄瓜基因组中。主要结果如下: 1.对于黄瓜离体再生芽的诱导,黄瓜萌发状念的幼嫩子叶在MS附加2.0 mg/L BA和1.0 mg/LABA的激素组合中再生最好。 2.新型激素TDZ对黄瓜离体外植体的不定芽诱导作用不明显,表现出较强的生长素活性,黄瓜子叶和下胚轴在MS附加有低浓度TDZ的培养基中迅速生根。 3.适量浓度的AgNO_3可以促进黄瓜离体子叶的再生,通常2.0 mg/LAgNO_3能发挥最好的效果,过量则抑制芽的再生。 4.在MS附加激素2.0 mg/L BA和1.0 mg/L ABA,并添加有2.0 mg/L AgNO_3时,津研四号和津研七号幼嫩子叶的不定芽诱导率分别为92.97%,82.43%,另一基因型绿霸春的幼嫩子叶芽的再生率为94.73%。 5.非转化子叶Km抗性测验表明:100 mg/L的卡那霉素完全抑制津研四号和津研七号的子叶再生,在此浓度下绿霸春产生极少的白化芽和畸形芽。 6.头孢霉素浓度在100~400 mg/L范围内对黄瓜子叶外植体不定芽诱导的抑制作用不明显。 7.烟草细胞悬浮系看护培养对黄瓜的遗传转化影响不明显。 8.对部分抗性植株提取DNA,经Multiplex PCR、Southern杂交检测证明,外源基因已整合入黄瓜基因组中。获得津研四号和津研七号转基因再生植株。 9.转基因植株田间接种试验表明,部分转基因黄瓜对霜霉病的抗性增强。


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