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沙门氏菌荧光PCR快速检测方法的建立与应用

石晓路  
【摘要】:就全球范围而言,沙门氏菌是引起细菌性食物中毒最常见的致病菌。传统的沙门氏菌检测方法通常需时4-7天,且操作繁琐,难以应对食物中毒的快速诊断以及食品企业和管理部门对食品安全的实时监控。这就对研究沙门氏菌快速检测方法提出了要求。 目前沙门氏菌快速检测方法多采用免疫学方法、核酸分子杂交以及聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)等方法,其中PCR方法越来越被广泛用于沙门氏菌的检测。但常规的PCR检测方法普遍存在着PCR产物污染、特异性不高及速度慢(需电泳染胶)等缺陷。荧光PCR技术是一种新近发展起来的检测技术,它的应用将从根本上解决这些问题。 本研究采用分子信标技术和TaqMan-MGB技术,建立了两种针对沙门氏菌的特异性荧光PCR检测方法,并初步运用于临床诊断和食品污染调查。实验结果如下: 1.沙门氏菌荧光PCR检测体系的建立 (1) 研究6种增菌液对荧光PCR反应的影响,选择SC(亚硒酸盐胱氨酸)增菌液为最佳培养沙门氏菌的增菌液。建立快速简便的样品前处理方法。 (2) 根据沙门氏菌属特异性基因invA设计了四对引物,并和Rahn设计的引物同时检测大量沙门氏菌及非沙门氏菌菌株,选用了其中一对特异性最强的新引物。 (3) 在这对引物间选择一段寡核苷酸序列,两端分别用FAM和MGB标记,优化反应条件,建立沙门氏菌TaqMan-MGB检测方法。 (4) 在这对引物问选择另一段寡核苷酸序列,两端各加上6bp互补的寡核苷酸形成分子信标,优化反应条件,建立沙门氏菌分子信标检测方法。 2.沙门氏菌荧光PCR检测体系的评价 (1) 特异性:用这两种荧光PCR方法分别检测200株沙门氏菌属菌株,均呈阳性;检测200株非沙门氏菌属菌株,均呈阴性。 (2) 灵敏度:以鼠伤寒沙门氏菌为实验菌株(40循环)。对于DNA抽提物,TaqMan-MGB方法的检出限为69fg/PCR体系,分子信标方法的检出限为346fg/PCR体系;对于菌液,TaqMan-MGB方法和分子信标方法的检出限均为2cfu/PCR体系;对于食品样品,TaqMan-MGB方法和分子信标方法的检出限均为2cfu/25g样品。 (3) 抗干扰性:反应不受其他杂菌的干扰,食品样品经处理后对反应无影响。 (4) 重复性:平行实验的结果一致性高,可重复性强。 3.沙门氏菌荧光PCR检测体系的应用 (1) 对深圳市肉菜市场的生肉、熟食进行抽查,200份生肉样品中,荧光PCR方法和传统方法均为阳性的为32份,荧光PCR阳性而传统方法阴性的为33份。 (2)对食品从业人员的肛拭子调查中,300份样品用荧光PCR方法和传统方法均有 3份检出阳性,符合率100%。 (3)细菌性食物中毒的快速诊断:45份样品用荧光PCR方法和传统方法均检出28 份沙门氏菌阳性,符合率100%。 本研究在国内首次建立了尘塑韭鱼卫卫塑巨鲤巡通丛九黝缈些旦困色 荧光”CR检测方法,并应甩工创趁途塑墅鱼壑峥的诊断,能埃到丛速准确检 测沙门氏菌的目的。建立的荧光PCR方法可作为现有 运用于临床检验工作和食品卫生监控,提高现有检狈 家标准检测方法的有力补充, 度


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