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SARS冠状病毒刺突蛋白S144-643的原核表达及其重要生物特性研究

费小战  
【摘要】:严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)又称“非典型性肺炎”,或“非典”,主要表现为肺炎及渐进性呼吸衰竭,死亡率为10%左右。它于2002年11月在中国广东省首先爆发,然后迅疾传播至全球32个国家及地区,其病原为一种新的冠状病毒(SARS associated coronavirus,SARS-CoV)。目前尚无特效药物用于SARS治疗,正在研究的各种抗病毒方法包括:用模拟受体分子或病毒的受体结合蛋白封闭病毒受体相互作用、用小肽分子抑制病毒与细胞膜间的融合、用特定中和表位研制亚单位疫苗等。SARS-CoV刺突蛋白S1是与病毒主要受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)相结合的病毒蛋白,其受体结合功能区包括在第318-510个氨基酸残基间的193个氨基酸片段内,该片段同时包含多个中和表位。本研究通过克隆表达SARS-CoV的S1蛋白受体结合区,为SARS-CoV受体ACE2功能区鉴定提供手段;同时,用所表达的S1蛋白为靶蛋白,从噬菌体展示随机肽库中筛选特异性结合多肽,为病毒受体及抗原抗体相互研究及抗病毒研究提供理论依据。 本论文将S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,在大肠杆菌中原核表达了该段S1蛋白。S1蛋白以组氨酸标签标记,蛋白分子量为50KD左右,以包涵体形式存在于细菌中。Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。同时Western blot证实,S144-643蛋白能与病毒受体ACE2结合。结合杨国良ACE2的有关研究材料,证实ACE2 N端的335个氨基酸与SARS-CoV S1的结合相关。 经过His.Bind试剂盒纯化的S144-643蛋白作为靶蛋白,从十二肽库中筛选与其特异性结合的多肽。经过3轮筛选,并经过ELISA和Dot-blot分析,得到10个阳性噬菌体克隆。序列分析结果显示,这10个阳性噬菌体克隆多肽序列中具有明显的保守序列。假病毒中和试验初步证实,其中两个噬菌体具有病毒中和活性。


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