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银杏查尔酮合成酶基因和苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及表达

许锋  
【摘要】:银杏(Ginkgo biloba)叶黄酮具有重要的药用价值,近年来对银杏叶黄酮的研究,特别是如何提高银杏叶黄酮含量已成为研究的热点与难点。对于提高银杏叶黄酮的相对百分含量的研究,前人已有大量的报道,事实证明采用生理生化途径调控银杏叶黄酮相对百分含量是一种有效的方法。同时,利用植物基因工程技术对银杏进行遗传改良或在分子水平上调控银杏叶黄酮合成途径中关键酶的活性,从而提高银杏叶黄酮含量也是一种行之有效的方法。银杏叶黄酮合成代谢中涉及到十几种酶,而查尔酮合成酶(CHS)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是银杏叶黄酮合成代谢途径中的关键酶。因而,开展银杏查尔酮合成酶和苯丙氨酸解氨酶的研究具有重要的理论意义与实践价值。 本研究以此为基础,以银杏品种家佛手叶为试材,采用CTAB法提取DNA和RNA。利用RACE技术从银杏中分离出查尔酮合成酶基因的cDNA全长序列,利用1对简并引物分离出银杏苯丙氨酸解氨酶基因的部分序列,并利用半定量RT-PCR法对其不同时期mRNA的表达与其活性变化以及黄酮积累的相互关系进行了初步的研究,主要结果如下: 1.采用CTAB法分别提取银杏叶的DNA和RNA,提取的DNA经电泳检测,有清晰的主带,酶切效果较好,说明提取的DNA质量较好。抽提的RNA经电泳检测,可见28s rRNA和18s rRNA两条主带;紫外吸收值测量,A260/A280接近2.0;反转录合成的cDNA经RAPD扩增,出现清晰的条带,这些说明提取的RNA与DNA纯度高,质量好。该法简便易行,适合于富含多糖、多酚植物材料的核酸提取。 2.采用1对简并引物,以银杏叶DNA为模板进行PCR扩增,得到了长863bp的银杏CHS基因片段,GenBank登录号为AY563038。利用TAIL-PCR方法,扩增得到了长为1238bp的CHS基因片段,包含CHS基因3'末端基因组序列,GenBank登录号为AY945936。 3.利用RACE技术从银杏中分离出类黄酮合成代谢的第一个关键酶基因CHS基因,并命名为Gbchs,GenBank登录号为DQ054841。Gbchs cDNA全长共1608bp,该序列包含poly(A)尾结构和一个长1173bp的最大开放阅读框架(ORF),编码391个氨基酸。通过核苷酸和蛋白质序列多重比较发现:Gbchs与其它植物的CHS基因高度同源。GbCHS蛋白质序列中包含与MsCHS相一致的活性位点。GbCHS蛋白质的三维空间结构模型表明:GbCHS与MsCHS蛋白质的晶体模型是非常相似的,这说明GbCHS蛋白质与MsCHS蛋白质可能有相同的催化功能。CHS的系统进化树表明,GbCHS与裸子植物的CHS基因聚类关系最近。Gbchs Southern blot结果表明银杏CHS是一个多基因家族。 4.利用简并引物,以银杏叶DNA为模板进行扩增,得到长862bp的银杏PAL基因


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