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百合种质离体保存技术研究

陈辉  
【摘要】:限制生长保存和超低温保存是植物种质离体保存的两种主要方法。限制生长保存是在保证植物种质遗传完整性的前提下限制试管苗的生长,减少继代次数,达到中期保存植物种质资源的目的。超低温保存是使植物材料在超低温条件下处于代谢活动停滞状态,是植物种质长期保存的理想方法。本研究以切花百合‘西伯利亚’和野生百合卷丹为实验材料,研究了探讨百合种质资源限制生长法保存和超低温保存的主要影响因素及指标,以及离体保存后再生植株的遗传稳定性,以期为实现百合种质资源的中长期保存提供科学理论和实践依据。主要研究结果如下: 1 通过研究不同培养基成分配比、渗透性化合物(高浓度蔗糖、甘露醇)浓度和生长抑制剂(ABA、CCC)浓度对百合试管苗保存效果的影响,初步建立了百合种质限制生长离体保存较理想方法:以鳞茎、茎段、花丝为外植体诱导不定芽的产生,并继代至MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基上生长。在MS或者大量微量元素均减半的1/2MS培养基中添加1.0~3.0mg/L的ABA能够有效延长继代间隔时间,离体保存百合试管苗长达9个月以上,存活率均在80%以上。培养基中加入50~90g/L高浓度蔗糖能够保存百合试管苗11个月以上。而10~50g/L甘露醇和10~40mg/L CCC对百合试管苗生长没有起到明显的限制作用。 2 以百合试管苗茎尖分生组织为材料,对玻璃化法超低温保存技术进行了实验研究,并通过正交设计试验对影响超低温保存存活率的主要影响因素(预培养基中蔗糖浓度、预培养时间和PVS2处理时间)进行了分析,初步建立了百合种质超低温保存的最佳技术方法:即选用继代45~60d左右的试管苗置于4℃低温锻炼一周以上,在无菌条件下剥取带有叶原基的茎尖分生组织(直径约1~2mm),在添加了0.1~0.3mol/L蔗糖的液体培养基中预培养1~2d,然后用MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油溶液装载20min,0℃下用冰冻保护剂PVS2处理60~120min。将材料装入冷冻管中,加入新鲜的PVS2冰冻保护剂,直接投入液氮保存。冻存后的材料在40℃水浴化冻,用MS+1.2mol/L蔗糖溶液洗涤10min,转移至MS+0.5mg/L BA+0.1mg/LNAA+0.3mg/LGA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂的再生培养基中常温下暗培养2周,之后转移至正常光照下培养。其存活率可达到50%以上。 3 采用包埋干燥法超低温保存百合茎尖分生组织,并对影响存活率的各主要因素进行了正交设计试验及分析。该方法最佳的保存技术还有待于进一步探索。 4 对离体保存后存活的材料进行再生培养,通过比较再生植株与对照植株的形态表现以及可溶性蛋白、过氧化物酶和酯酶同工酶图谱,没有发现遗传上的变异,这初步证明了以上保存方法的可行性。


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