几种不同鱼类肥胖基因的克隆与鲤肥胖基因的表达研究

【摘要】：自从人和小鼠的肥胖基因克隆后,肥胖基因一直成为国内外研究的热点。肥胖基因编码的蛋白质(leptin)是反映体内脂肪含量的重要信号因子,leptin主要作用于下丘脑的特异受体,通过下丘脑进行摄食调控和维持能量代谢的平衡,leptin还对机体的免疫应答,繁殖功能,神经内分泌等功能具有重要的作用,具有广泛的生物学效应。现在已经克隆出了人、鼠、猪等动物的肥胖基因,并对其生物功能和表达特点进行了深入的研究。而有关鱼类的ob基因及其功能的研究很少见相关报道。鱼类品种繁多,不同品种的鱼类具有不同的摄食习性,并且鱼类体内脂肪的含量、摄食量以及饱食感与其摄食习性均有较大程度的差异,而对鱼类ob基因的研究将有利于阐明不同品种鱼类的摄食习性与机体的脂肪含量、摄食量以及饱食感之间的关系,对研究鱼类摄食调控的分子机理具有重要意义。本研究试图克隆不同摄食习性鱼类的ob基因,研究该基因在鱼体内和体外的表达特点,为研究鱼类ob基因的功能奠定基础。主要研究工作和结果如下: 1.几种不同鱼类肥胖基因的克隆 提取不同摄食习性鱼类肠系膜脂肪组织的RNA,包括杂食性鱼类:鲤、鲫;草食性鱼类:草鱼、团头鲂;滤食性鱼类:鳙、鲢;肉食性鱼类:青鱼、乌鳢、大口鲇、鳗鲡、史氏鲟。利用RT-PCR技术从鲤肠系膜脂肪组织中扩增出鲤肥胖基因的cDNA编码序列,将其克隆至pMD18-T载体进行序列测定。测序结果表明,几种不同摄食习性鱼类的ob基因编码区均由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸,几种不同鱼类ob基因之间仅有2-4个核苷酸发生变异,导致1-2个氨基酸发生改变。鱼类ob基因的核苷酸和氨基酸的同源性均达到99%,与Genebank中ob基因序列的同源性进行比较,ob基因具有很强的保守性,鲤ob基因与人、猪、小鼠核苷酸同源性分别为:84%、86%、95%,氨基酸的同源性分别为84%、82%、96%。 2.鲤不同组织和不同胚胎发育阶段ob基因的表达 提取鲤不同组织(心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉、脑、脂肪)和不同发育阶段胚胎(卵巢、桑椹期、囊胚、原肠胚、神经胚、肌肉效应期、心跳期、出苗前期、出苗期)的RNA,利用RT—PCR方法对其进行检测,结果表明,鲤ob基因在鲤不同组织中均有表达,在肝脏和脂肪组织中的表达量较高,在其他组织中也有一定的表达;鲤ob基因在未受精卵和不同的胚胎发育阶段均有有表达。由于未进行定量RT-PCR,本研究尚不能确定鲤ob基因在不同的胚胎发育中是否具有发育性变化。人和小鼠的ob基因主要在脂肪组织中表达,在胚胎中也有表达,本研究表明鲤ob基因的表达与人和小鼠相比具有较大的差异。 3.鲤ob基因的表达节律及不同生理条件对ob基因表达的影响 本研究由两部分组成。试验Ⅰ:鲤ob基因在不同生理条件下的表达,将40尾鲤按体重随机分成4组,每组10尾,分别设置为正常对照组、饥饿组,饱食组和高