猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究

【摘要】：猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说,目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。 与灭活疫苗和亚单位疫苗不同,自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。这样,弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。构建胸膜肺炎放线杆菌突变株的传统方法存在很多缺陷。如利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性,只适合于表型发生明显变化突变子的筛选,而不导致明显表型变化的突变株就不能够通过这些方法获得;而通过同源重组导致靶基因突变方法获得的突变株最后含有抗性标记,由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。鉴于上述背景,本研究通过使用同源重组技术和负向选择方法(counterselection strategy)构建了不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因工程突变株,随后对其生物学特性进行了研究,主要研究内容包括: 1.外膜脂蛋白(omlA)基因启动子序列验证及作为启动子启动绿色荧光蛋白(GFP)基因的功能特性研究 由于胸膜肺炎放线杆菌血清1型(S4074)外膜脂蛋白基因转录起始位点已经得到证实,本研究以APP血清1型基因组DNA为模板,采用PCR扩增157 bp omlA基因启动子序列,序列测定证实无误后以正向的方式将其连接到不带启动子的绿色荧光蛋白基因(GFP)上游,构建质粒pMSKOGFP。通过电穿孔将质粒pMSKOGFP电转化到APP,在荧光显微镜下观察转化子发荧光的情况。结果含有质粒pMSKOGFP的APP转化子能够表达GFP,表明157 bp omlA基因启动子序列能够启动GFP基因在APP中表达。 2.sacB基因在APP中表达特性研究 枯草杆菌sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,表达sacB基因的革兰氏阴性细菌在含有5%蔗糖的培养基上不能生长。为了描述sacB基因在胸膜肺炎放线杆菌的表达特性,本研究采用PCR从质粒PGS284中扩增sacB基因,将它按照omlA基因启动子序列相同的方向克隆到质粒pMSK-omlA中获得重组质粒pMSKOS。同时,将单独