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猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究

黄红亮  
【摘要】:猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病。该病给集约化养殖业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,目前已分离鉴定了15种血清型的APP,其毒力因子非常复杂,型间交叉免疫保护率低,因而该病的诊断与防制相当困难。APP的Apx外毒素是其主要的毒力因子。已证实了ApxⅠ、ApxⅡ与ApxⅢ的溶血活性及对巨噬细胞与嗜中性粒细胞的毒性作用,且ApxⅢ被证实有诱导细胞凋亡的活性,而ApxⅣ仅具有微弱的溶血活性,其它作用尚不清楚。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验(IHA),该方法具有血清型特异性,不适合于对APP的普查。最近发现的ApxⅣ存在于所有血清型APP中,且具有种特异性,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。ApxⅣ的另一特点为体内诱导的毒素,而目前市面上用体外培养方法制备的疫苗中均不存在ApxⅣ,因此基于ApxⅣ的诊断方法可以鉴别诊断自然感染猪与疫苗免疫猪。为了建立有效的诊断方法及对APP外毒素作用机制进行深入研究提供特异性单克隆抗体,我们开展了以下工作: 1 apxⅣ基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达 依据APP血清1型的apxⅣ基因序列(GeneBank登陆号:AF021919)合成特异性引物,分三段从APP 0306SYML中分别扩增了apxⅣ基因的5′-端3.6Kb、5′-端2.5Kb和3′-端3.0Kb片断,分别克隆到pMD-18T,获得重组质粒pT apxⅣ3.6、pT apxⅣA5与pT apxⅣA3,并进行了测序:将apxⅣA5与apxⅣA3分别克隆到质粒pET-28b的T7启动子下游,构建了重组原核表达质粒pET apxⅣA5与pET apxⅣA3,分别用于表达ApxⅣ N-端与C-端蛋白,转化E. coli BL21(DE3)后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量分别为90kDa与115kDa,分别命名为rApxⅣAN与rApxⅣAC,表达产物主要以包涵体形式存在,Western blot证实表达产物具有良好的反应原性。 2 鉴别诊断方法的建立 用大肠杆菌表达的重组蛋白rApxⅣAN建立了ApxⅣ-ELISA方法。用方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为2.97μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:80。通过检测53份猪传染性胸膜肺炎阴性血清,确定该方法的临界值为0.336。该方法的重复性良好。用该方法从副猪嗜血杆菌(HPS)、产毒素巴氏杆菌(DNT~+Pm)、大肠杆菌(E. coli)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪衣原体(CP)的标准阳性血清及APP全菌灭活苗与类毒素菌苗免疫猪血清中检测不到ApxⅣ抗体,而从APP活菌感染的动物血清中能检测到ApxⅣ抗体,说明该方法不仅具有种特异性,只能用于APP感染的检测,还可以鉴别诊断全菌灭活疫苗或亚


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