苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究

【摘要】：苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple cholortotic leaf spot virus,ACLSV)是危害梨和苹果及其它一些果树的重要病毒,对果树的生长、产量、果品质量等造成严重的影响。本研究以ASGV和ACLSV为对象研究其生物学、血清学特性和分子变异。目的就是要通过对不同来源分离物的分子变异与生物学和血清学特性的比较分析,从分子水平上探索ASGV和ACLSV生物学多样性和血清学差异与分子变异的关系,结果如下: 1.通过昆诺藜(Chenopodium.quinoa)接种鉴定和ELISA检测,从梨和苹果上获得ASGV 23个分离物。采用TC-RT-PCR对这些分离物进行扩增,均获得特异的扩增片段,PCR产物经5%PAGE电泳,出现大小约500、530和600bp的三种迁移率不同的泳动带型。根据PCR产物电泳迁移率的差异,选取3个来源于梨的分离物P-L4、P-6-1-17和P-3-2-67的PCR产物进行克隆与序列测定。经BLAST搜索,三个分离物的扩增片段与苹果分离物P-209的CP基因3′端核苷酸序列同源性分别为92.2%、90.4%和88.4%。3个分离物间的核苷酸序列也有较大差异,P-L4/P-6-1-17为95.5%、P-L4/P-3-2-67为90.4%、P-6-1.17/P-3-2-67为88.6%。 2.选取生物学和血清学特性上存在较大差异的ASGV梨分离物P-6-1-17、P-4-1-69、P-L2和P-D-21,采用RT-PCR法对3′端进行扩增,所获扩增片段经序列测定,全长分别为1089nt(P-6-1.17、P-L2)和1069nt(P-4-1-69、P-D-21)。4个分离物的CP基因均由714nt组成,其核苷酸和推导编码蛋白氨基酸序列同源性分别为89.8%～96.4%和94.9%～97.9%。将我国4个分离物的CP基因与已报道ASGV分离物及分子变种进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明我国ASGV分离物至少可分为2个组群,其中生物学表现明显不同于其它分离物的P-L2,其CP基因核苷酸序列显示较大的变异。 3.通过昆诺藜接种鉴定和ELISA检测,从梨、苹果和桃上获得ACLSV 13个分离物。用PAS-ELISA和DAS-ELISA对这13个分离物进行检测,结果PAS-ELISA只检出来源于桃的HBP分离物,而DAS-ELISA检出来源于桃的HBP、PE-T-5和PE-5 3个分离物。然而采用RT-PCR和TC-RT-PCR对这些分离物进行扩增,均能获得特异的358bp目标片段。 4.在昆诺藜和苋色藜上均产生系统褪绿症状,且血清学上相关的来源于桃和苹果的HBP、ACLSV-C 2个分离物,通过RT-PCR法分别获得约1.8kb的目标片段。所获扩增片段经序列测定,全长分别为1768nt(GenBank登录号AY728180)和1751nt。2个分离物的CP基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将这2个分离物的CP基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析结果表明,HBP与从苹果和樱桃