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金黄色葡萄球菌B型肠毒素的溶液构象及菌体生长环境效应

王小红  
【摘要】:金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus)是人类和某些动物的病原菌之一,其致病力强弱主要取决于产生的毒素和侵袭性酶的能力,其中金黄色葡萄球菌耐热性肠毒素,是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的主要原因,因此,这方面的研究已成为科学家们普遍关注的重要课题。本文以主要产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌S6菌株为研究对象,采用X—射线衍射、扫描电镜、原子力显微镜、分子振动光谱(红外、激光拉曼)、圆二色谱、荧光光谱等现代分析技术表征金黄色葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B,简称SEB)的聚集态结构、三维立体形貌、分子链构象及蛋白质二级结构组成。同时着重研究了肠毒素在稀溶液状态和外界环境改变时的构象特征及可能的去折叠过程,尝试用蛋白质构象理论揭示肠毒素耐热的根本原因,寻找其耐热的可能优势构象,建立研究蛋白质构象与生物学活性相关性的新方法。此外,还从酸奶发酵菌株和金黄色葡萄球菌的混合培养特性出发,研究了乳酸菌及代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑制作用及其在抑制过程中热效应的微量变化,从热化学的角度探讨其作用机制。主要研究结果如下: 1.金黄色葡萄球菌B型肠毒素的分离纯化 采用玻璃纸覆盖琼脂平板法培养金黄色葡萄球菌,首先利用羧甲基纤维素阳离子CM-32柱层析,对B型肠毒素进行初步分离富集,然后依据筛分原理按分子量大小经Sephadex G-75凝胶进一步纯化,得到电泳纯B型肠毒素,得率为26.8%,紫外吸收光谱测得其特征吸收峰为276.6nm,SDS-PAGE凝胶电泳分析其相对分子质量为2.8×10~4,与文献报道值一致。 2.金黄色葡萄球菌B型肠毒素的结构表征 利用X-射线衍射、扫描电镜、原子力显微镜、傅里叶变换红外光谱、激光拉曼光谱等现代分析手段对金黄色葡萄球菌B型肠毒素的聚集态结构、分子链形态,二级结构等进行了表征。结果表明,SEB为一种单纯蛋白,其聚集态包含结晶区和无定形区,结晶度为37.8%,其分子聚集在一起,形态主要为片状和平板状,具有一定的规整性。原子力显微镜首次观察到SEB在稀溶液状态下的单分子链长度约为1500nm,分子链宽度约为20~40nm,分子链高0.6nm。SEB的傅里叶变换红外光谱和激光拉曼光谱分析表明,SEB的二级结构单元主要为β—折叠和α—螺旋,无规卷曲含量较少,侧链C—C—S—S—C—C构型为反式—扭曲—反式。 3.金黄色葡萄球菌B型肠毒素的稀溶液构象及去折叠作用 研究大分子的溶液构象和蛋白质的去折叠作用是近来揭示蛋白质生物活性及其与高级结构相关性的重要切入点。金黄色葡萄球菌B型肠毒素水溶液(浓度为


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