具细胞毒活性海洋微生物的分离筛选及次级代谢物的研究

【摘要】：号称第二号“杀手”的肿瘤疾病严重威胁着人类的生命健康,对其仍无医治良方。在治疗癌症方面,天然来源药物发挥着重要的延年益寿作用。自20世纪40年代从一株点青霉(Penicillium notatum)中发现青霉素后,陆地微生物,尤其是链霉菌属,因它们能产生丰富的且具有一定生物活性作用的次级代谢物而受到广泛关注。经过几十年的大量开发,从陆地微生物中开发到新型次级代谢产物的几率已大为降低,因此科学家们将目光投向了占陆地表面积达70%以上的海洋环境,期待从中能开发到具新型结构的化合物。生活在海洋环境当中的海洋微生物种类繁多,且因生存环境独特(高压、高盐和高温等)而能够产生结构新颖、功能独特的次级代谢物。因此,本论文开展了从海洋微生物次级代谢产物中筛选具细胞毒作用的先导化合物的研究工作。 本文对从海南岛近海区采集的59个样品,通过采用IM、GS、SC、GA、M1、YE、GIN、HV、CZ和MT等10种分离培养基和加热、SDS、苯酚、几丁质富集和YE富集等5种预处理方法,共分离到1409株海洋微生物菌株,其中细菌962株,丝状真菌168株,放线菌279株。同时发现,采用加热和SDS等2种预处理方法和GS、SC和YE等3种培养基有利于放线菌的分离。 本研究对MTT法和稻瘟霉孢子法这两种筛选模型对海洋微生物细胞毒活性菌株筛选的相关性进行了比较,以确定出稻瘟霉孢子法能否作为本实验室的细胞毒药物快速筛选方法。结果表明,当采用稻瘟霉孢子法作初筛时,假阳性率可达26.26%,且会漏筛掉一半以上的细胞毒活性菌株,因此不适合作为细胞毒活性菌株的初筛模型。采用MTT法对筛选分离得到的1409株海洋微生物菌株的发酵液进行了初步筛选后共获得208株活性菌株,其中细菌的阳性率为12.75%,放线菌为22.10%,真菌为14.29%。 在本研究中对分离获得的对白血病细胞系K562具强细胞毒活性(ID_(50)1000)的3株链霉菌050642、060386和060524等菌株进行了生理生化性状的初步研究,结果表明3株菌遗传稳定性好,均有一定的开发价值。 利用硅胶柱层析、反相C_(18)柱层析和Sephadex LH-20等层析分离手段,通过活性跟踪法对具强细胞毒活性的链霉菌菌株060524的次级代谢物进行了分离,同时利用质谱(ESI-MS或EI-MS)、核磁共振(~1H NMR、~(13)C-NMR、DEPT和