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枯草芽胞杆菌高产聚-γ-谷氨酸及其应用研究

陈雄  
【摘要】:本文优化了分别以猪粪、奶牛粪为主要原料固体培养专利菌株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis CCTCC202048)高产聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)的工艺,对γ-PGA进行了初步表征,研究了γ-PGA的流变特性和降解特性,探讨了γ-PGA保肥增效的作用和机理,揭示了γ-PGA对生物农药苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)制剂的保护作用。 应用3个正交试验优化了以猪粪为主要成分固体培养B.subtilis CCTCC202048高产γ-PGA的工艺。优化培养基配方为:猪粪62.3%(w/w,干重),黄豆饼粉25.0%,麦麸5.0%,谷氨酸5.0%,柠檬酸2.5%,MnSO_4·H_2O 0.2%;优化培养工艺为:装料量15.0g,含水量60%,对数中期接种,接种量4%,初始pH9.0,培养温度37℃,时间48h。优化试验中,平均γ-PGA产量为6.0%,氨态氮从3.3‰降到0.7‰,全氮、全磷、全钾的变化不明显,速效磷、速效钾的含量略有增加。将优化培养基配方用于野外堆肥试验,γ-PGA的平均产量为4.5%。本研究结果将在减少猪粪的污染,增加猪粪肥效和开发一种新型的保水保肥的有机肥料方面打下坚实基础。 应用响应面方法对以奶牛粪为主要成分固体培养B.subtilis CCTCC202048高产γ-PGA的培养基进行了优化。首先用Plackett-Burman方法对相关影响因素的效应进行了评价,并筛选出了有显著正效应的黄豆饼粉、麦麸和谷氨酸。随后用Box-Behnken实验和响应面分析方法确定了优化培养基配方:奶牛粪56.32%(w/w,干重),黄豆饼粉23.35%,麦麸16.08%,谷氨酸4.25%;用正交试验优化的最佳发酵条件为:装料量15.0g,含水量60%,对数中期接种,接种量8%,初始pH9.0,培养温度40℃,时间48h。在优化条件下,平均γ-PGA产量为4.98%,氨态氮含量从2.3‰降到0.66‰,全氮、全磷、全钾的变化不明显,速效磷、速效钾的含量略有增加。优化结果与实际发酵情况吻合较好。将最佳培养基配方应用于野外堆肥试验,γ-PGA的平均产量为3.58%。本工艺在奶牛粪的无害化处理、提高奶牛粪肥效、改善有机肥料的保水保肥能力方面有良好的前景。 采用UV、HPLC、FT-IR和NMR等多种测试手段对B.subtilis CCTCC202048代谢产物γ-PGA进行了初步表征。供试样品经水解后,HPLC色谱图出现一个峰,与谷氨酸相同,说明其仅由谷氨酸聚合而成;红外光谱图的特征吸收峰与标准品一致,表明两者具有相同的化学结构,初步确定试验精制产品为γ-PGA。γ-PGA的核磁共振氢谱图进一步说明γ-PGA由谷氨酸组成。 不同浓度、温度和pH值下,对γ-PGA流变特性的研究证明γ-PGA溶液为非牛顿流体,有剪切变稀现象。在20-50℃范围内,粘度随温度的升高呈指数递减,在50-70℃范围内,粘度随温度的升高下降趋势减缓。粘度随γ-PGA溶液浓度增加呈指数形式增加。在pH5-11,粘度较稳定,γ-PGA溶液表观粘度对酸度更为敏感,在


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