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马铃薯块茎低温糖化机理及转化酶抑制子基因的克隆与功能鉴定

成善汉  
【摘要】:马铃薯是世界第四大粮食作物,用途广泛,其加工产品薯片和炸薯条是风靡全球的食品。为了抑制常温贮藏产生的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等现象及延长加工周期,常将马铃薯块茎贮藏在低温条件下。但低温常使块茎中的淀粉加速转化为还原糖,高温油炸加工时,还原糖与块茎中游离的氨基酸发生反应,严重影响炸片或炸条的色泽和品质。块茎“低温糖化”是个复杂的数量性状,涉及淀粉—糖代谢的多种路径,调节和反馈因子多,因此“低温糖化”的机理研究是马铃薯加工品质改良的重要基础工作。本研究拟探索不同温度贮藏条件下马铃薯淀粉—糖代谢的主要酶类与还原糖含量的动态变化关系,明确其主要的调控因子。在此基础上,结合前人的研究结果,分离克隆淀粉—糖代谢关键酶的调控基因,并通过转化马铃薯进行功能验证,以进一步揭示马铃薯块茎淀粉—糖代谢的分子机理,为改良马铃薯加工品质提供理论依据和技术基础。研究取得的主要结果如下: 1.以不同贮藏温度条件下的鄂马铃薯1号(E1)和鄂马铃薯3号(E3)品种为材料,对贮藏块茎还原糖、总糖含量及淀粉-糖代谢中酶活性变化规律进行研究,以明确马铃薯炸片色泽指数的主要影响因素。结果表明,贮藏期间低温是促进块茎还原糖累积的主要影响因素,还原糖含量与炸片色泽具有极显著直线正相关关系。进一步分析表明,在4℃贮藏条件下,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、尿昔二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和蔗糖合成酶活性(SuSy)与块茎还原糖含量呈显著负指数相关,酸性转化酶(Acid Inv)和碱性转化酶(Alkaline Inv)活性与块茎还原糖的积累呈显著直线正相关,是淀粉—糖代谢过程中影响块茎“低温糖化”的主要因子。 2.转化酶抑制子是一类同源性较低的蛋白质家族,通过转化酶抑制子的调控可能达到抑制转化酶活性,进而调控还原糖积累的效果。本研究根据已报道的烟草转化酶抑制子序列设计特异引物,通过RT-PCR法在烟草T1系中成功分离到液泡转化酶抑制子基因Nt-inhh全长cDNA。序列分析表明,该基因编码区与报道的Nt-inhh基因完全一致。通过构建35S和块茎特异的patatin启动子调控下含有Nt-inhh基因cDNA的表达载体转化马铃薯。分析转基因植株块茎在4℃和20℃贮藏一个月后还原糖含量与液泡酸性转化酶活性表明,Ⅵ活性下降幅度为22.7%(株系A-3)至78.7%(株系B-13),还原糖下降幅度为20%(株系A-17)至80.5(株系A-30),说明Nt-inhh cDNA在马铃薯中的表达成功抑制了液泡酸性转化酶的活性,导致还原糖含量降低。实验还进一步证实了低温贮藏块茎液泡酸性转化酶活性与还原糖含量呈正相关关系。 3.转化酶抑制子是高等植物普遍存在的一类蛋白质家族,本研究用RT-PCR结合5'RACE方法从马铃薯栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh cDNA。序列分析表明,St-inh基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将St-inh基因克隆


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