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应用siRNAs抑制乙型脑炎病毒复制及乙型脑炎“自杀性”DNA疫苗研究

刘学芹  
【摘要】:乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)(简称乙脑),是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)引起的一种严重危害人畜健康的虫媒病毒性疾病。该病对人类危害巨大,约三分之一的患者会死亡,存活的患者中有40%-70%会留下神经后遗症。乙脑也是危害养猪业的重大疫病之一,该病感染猪造成的主要经济损失是导致严重的繁殖障碍性疾病。目前对于该病还没有有效的治疗方法。RNAi是机体本身存在的天然抗病毒机制,为人们预防和治疗病毒感染开启了希望之门。本实验利用RNAi技术,从抑制病毒复制的角度,为乙脑的免疫预防开辟新途径。同时,本研究还开展了乙脑病毒主要免疫原性基因E和NS1的“自杀性”DNA疫苗研究,并在此基础上探讨了牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)的VP22蛋白对乙脑病毒“自杀性”DNA疫苗免疫效果的影响。主要研究内容如下: 1.siRNAs对乙脑病毒NS1基因表达的抑制 以乙脑病毒的NS1基因为靶基因,设计合成了4个siRNA序列,并构建了各自的表达质粒(pS-NS1A,pS-NS1B,pS-NS1C,pS-NS1D);构建了NS1基因与EGFP融合的真核表达质粒(pCDNS1-EGFP),并实现了二者在Vero细胞和BHK-21细胞中的融合表达;将siRNA表达质粒与pCDNS1-EGFP共转染细胞后,经荧光观察、流式细胞仪检测、Western blot、RT-PCR等方法证实:在4个siRNAs序列中,pS-NS1A的抑制作用不明显,而pS-NS1B、pS-NS1C、pS-NS1D对NS1基因表达有显著的特异性抑制作用,其中pS-NS1C和pS-NS1D抑制效果达到80%—90%。 2.siRNAs对乙脑病毒复制的抑制 将上述构建的4个siRNAs表达质粒分别转染BHK-21细胞,24小时后感染130PFU乙脑病毒,经间接免疫荧光观察、Western blot、空斑形成实验、RT-PCR等方法证实:在4个siRNAs序列中,pS-NS1A的抑制作用不明显,pS-NS1B,pS-NS1C,pS-NS1D对乙脑病毒复制有显著的特异性抑制作用,其中pS-NS1C,pS-NS1D抑制效果达到79%—86%。 3.乙脑病毒E、NS1基因“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗的免疫效果比较 将乙脑病毒E和NS1基因分别插入到“自杀性”DNA疫苗载体—PSCAI(pS),分别构建了pSNS1、pSE两种“自杀性”DNA疫苗。在此基础上,将BHV-1的VP22蛋白基因分别插入到NS1、E基因的上游,使VP22与NS1、E基因融合表达,从而构建了另两种“自杀性”DNA疫苗:pSBNS1、pSBE。间接免疫荧光实验证实所构建的质粒均在BHK-21细胞中获得表达。小鼠的动物试验表明:NS1基因的“自杀性”DNA疫苗可以诱导显著高于常规DNA疫苗的ELISA抗体和细胞免疫水平;E基因的“自杀性”DNA疫苗与常规DNA疫苗相比,在诱导体液免疫方面没有优势,


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