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新型核酸电化学传感器的构建与应用研究

韦明元  
【摘要】:采用分子膜层层组装的原理,选用亲合素作为DNA固定的第一层介质膜,第二层核酸膜通过层层静电吸附的方法固定到氧化铟锡(ITO)电极表面,制备出核酸传感器界面。选择DNA嵌入剂——二联吡啶二吡啶并[3,2-a;2',3'-c]吩嗪钌(Ru(bpy)_2dppz~(2+),以下简称Ru-dppz)作为电化学指示剂,与核酸膜结合后,在草酸/草酸钠缓冲液中进行电化学检测,建立了一种新型的核酸电化学传感器。主要研究内容如下: 1.分别采用石英晶体微天平(QCM)和电化学方法对核酸的固定进行了验证和定量表征,计算出双链DNA、单链DNA、聚鸟嘌呤核苷酸(Poly-G)和聚胞嘧啶核苷酸(Poly-C)在电极表面的固定量均为3.2ng/mm~2。经氧化苯乙烯损伤后的DNA的固定量略有增加,为4.2ng/mm~2。 2.由于电子给予体草酸钠能不断地还原Ru(bpy)_2dppz~(3+)而使电流信号得到催化放大,同时草酸钠在ITO电极上的背景电流很低,使得信噪比得到显著提高。通过将比较,经草酸钠放大之后的电流信号提高了120倍,信噪比提高了14倍。结合QCM分析,可得到该传感器对双链DNA的检测限为160pg/mm~2(吸附浓度为20ng/mL)。双链DNA膜所对应的催化电流信号明显高于单链DNA和Poly-C,表明该传感器对双链DNA具有较好的选择性。 3.使用该核酸传感器的膜层伏安法考察了Ru-dppz与双链DNA的结合模式。在Ru-dppz的吸附浓度较低时,可以观察到一个电位随着吸附浓度的增加而从1.25V迁移到1.1V氧化峰(峰Ⅰ);在吸附浓度较高时,在1.25V处出现了一个不受吸附浓度变化的影响的氧化峰(峰Ⅱ)。分别采用Poly-G和Poly-C以及Os(bpy)_2dppz~(2+)进行了对照实验,结果表明峰Ⅰ向阴极移动是由于双链DNA中鸟嘌呤碱基对Ru-dppz的催化氧化。本研究提出Ru-dppz与双链DNA的“双位点”结合模式:位点一能氧化鸟嘌呤碱基,形成峰Ⅰ;位点二不能氧化,形成峰Ⅱ。采用Mg~(2+)进行置换实验,证明了位点二为静电吸附位点。嵌入作用能使Ru-dppz分子与DNA内部的碱基充分接触,因此位点一为嵌入位点。 4.使用该新型核酸电化学传感器对核酸损伤进行了检测。损伤DNA的催化电流信号显著高于未损伤DNA,前者是后者的2.2倍。通过荧光分析,首次得到Ru(bpy)_2dppz~(2+)与损伤DNA的结合常数(K=1.07×10~7M~(-1))和结合比(0.68)。嵌入剂与损伤DNA结合物的荧光强度是未损伤DNA的1.5倍,说明损伤后嵌入剂的结合数量增加了1.5倍。损伤DNA电化学检测信号增高的主要原因是信号指示剂嵌入电极表面核酸数量的增大。


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