魔芋离体形态发生机制及其繁殖技术

【摘要】：魔芋(Konjac)是植物界中迄今发现唯一能大量合成葡苷聚糖(Konjac glucomannan)的高等植物，属天南星科(Araceae)魔芋属(Amrophophallus Blume)，为多年生草本植物，广泛分布于我国西南山区，具有悠久的栽培和利用历史。魔芋葡甘聚糖是魔芋地下球茎主要贮藏物质，为一种高分子量碳水化合物，因具有良好的胶溶性、凝胶性、增稠性、成膜性及与其它植物胶的优良复配性等优点而在食品、化工、医药保健、环保等领域具有广泛的应用。因此，魔芋具有极高的市场开发和利用价值。 魔芋为单叶柄支撑的单叶植物，通常利用球茎着生的根状茎进行无性繁殖，其繁殖系数极低，且多年沿用无性繁殖造成病原菌的积累、种性的退化，进而导致魔芋产量下降、品质劣化。由于缺乏稳定的良种繁育体系，种芋的数量和质量已经成为魔芋生产发展的瓶颈。自上个世纪80年代以来，许多研究者试图利用组织培养技术生产脱毒试管苗，以繁殖种芋，但试管苗因移栽成活率低且对田间管理技术要求较高，不能实现周年供应和长距离运输等缺点，无法在实际生产中广泛运用。二十世纪90年代以来，随着对植物变态器官发育机理认识的不断深入，人们在试管中已成功诱导出了块茎、球茎、鳞茎等营养繁殖器官，其中马铃薯试管块茎生产体系最为成熟，已经实现了工厂化生产，但有关魔芋试管球茎的研究国内外尚未见报道。本研究以花魔芋(A．rivieri)和白魔芋(A．albus)为材料，对魔芋试管球茎的形成及魔芋组织培养繁殖方式开展了系列研究，主要结果如下： 1．幼嫩叶柄是魔芋组织培养较好的外植体，愈伤组织形成率高，状态好。MS+1.0mg／L NAA+1.0mg／L BA适宜于愈伤组织诱导，而MS+0.5 mg／L NAA+0.5 mg／L BA有利于愈伤组织增殖。愈伤组织在继代培养过程中可形成3种不同的类型，即Ⅰ：水渍状，半透明；Ⅱ：淡黄色，结构疏松；Ⅲ：浅红或绿色，呈瘤状或球状，结构致密。在分化培养基上，Ⅰ型愈伤组织不能分化出芽，Ⅱ型可分化出不定芽，而Ⅲ型可通过拟球茎再生完整植株。这三种类型愈伤组织在特定的培养条件下可相互转化。组织学观察显示，三种类型的愈伤组织其组成细胞类型明显不同，其中Ⅲ型愈伤组织由保守分裂型细胞组成，其细胞中含有淀粉和葡甘聚糖颗粒，是一种半组织化结构。中等浓度(1.0～2.0 mg／L)的细胞分裂素(BA、KT、ZT和TDZ)与低浓度(0.1～1.0mg／L)的NAA配合均能促使Ⅲ型愈伤组织再生植株。 2．魔芋离体形态建成以器官发生途径为主，拟球茎和芽发生是主要形式。组织学观察显示，魔芋叶柄无维管组织形成层，维管束外层薄壁在培养过程首先启动脱分化，进而形成愈伤组织。魔芋形态建成以器官发生途径为主，在特定培养条件下也可形成体细胞胚，但频率极低，且绝大部分体胚因高度畸形化而不能形成再生植株。魔芋可通过不定芽器官发生途径或拟球茎器官发生途径形成植株，通过拟球茎形成的植株不需生根培养就具有完整的根系，而不定芽在发育过程中不能直接生根且植株生长势弱。不定芽和拟球茎均起源于Ⅲ型愈伤组织的次表皮细胞，这类细胞在分化过程中首先形成拟分生组织团。拟分生组织团在分化培养中既可直接形成芽原基，进而发生不定芽，可形成一种中间的球状体，这种球状体具顶芽分生组织，叶原基不明显，它可进一步发育成拟球茎，进而形成完整植株。 3．内源GA_3含量增加伴随着不定芽发生，而JA含量增加伴随着拟球茎发生，内源激素平衡是器官发生方式的关键调空因素。魔芋叶柄薄壁细胞在脱分化形成愈伤组织过程中，其内源激素(IAA、GA_3、ABA和JA)含量发生了明显的变化。内源IAA含量培养初期缓慢下降，10d后快速上升，30d后达到平稳。内源ABA含量在培养20d内呈下降趋势，之后迅速上升。内源GA_3和JA含量则在整个愈伤组织诱导过程中迅速下降。研究发现，三种内源激素(GA_3、ABA和JA)在形成芽和拟球茎的愈伤组织中含量变化明显不同。内源GA_3水平在拟球茎发生过程中变动不大，而在不定芽发生过程中快速上升，其绝对含量也比前者高；内源ABA在拟球茎发生过程中基本维持稳定，而在不定芽发生过程中则迅速下降；内源JA含量在拟球茎形成过程中呈明显上升趋势，而在不定芽发生过程中变化不明显。只有内源IAA无论是拟球茎还是不定芽形成过程其含量均呈下降趋势。内源GA_3与ABA和JA的平衡水平在两种不同器官发生途径中呈现出明显的差异，但GA_3／JA差异最为显著，在两种器官发生途径中其变化趋势完全相反。上述结果说明，魔芋离体器官发生形式与内源激素变化及平衡水平相关。 4．魔芋试管球茎(即拟球茎)的形成受培养基和培养条件的影响。中等浓度的BA(1.0～2.0 mg／L)与低浓度的NAA(0.1～0.5 mg／L)配合有利于Ⅲ型愈伤组织形成试管球茎，其中以MS+2.0 mg／L BA+0.5 mg／L NAA表现最佳。在一定范围内提高培养基中蔗糖浓度有利于白魔芋试管球茎形成，其中6％(w／v)蔗糖效果最好。而花魔芋试管球茎形成所要求的蔗糖浓度较低(4％)。光周期对试管球茎的发生影响不明显，而培养温度的影响则较大，22℃条件下，花魔芋和白魔芋试管球茎形成率、形成个数和单球茎鲜重均达最大值。试管球茎在培养过程可产生次级小球茎以进行增殖，但自然增殖率较低，通过损伤主芽方法打破主芽顶端优势，可促使次级小球茎的发生。 5．选择性培养魔芋愈伤组织有助于降低再生植株遗传变异频率。对魔芋Ⅲ型愈伤组织进行选择并于适宜培养基上继代培养，弃除状态发生改变的愈伤组织类型，获得不同培养时期的4个再生植株群体G0(初代培养产生)、G2(继代3次产生)、G4(继代5次产生)和G7(继代8次产生)。经两种分子标记技术(RAPD和ISSR)分析显示，G0群体变异频率最高(RAPD：15.6％；ISSR：18.0％)，G2、G4和G7的变异频率依次下降。四个群体中，G0再生植株的RAPD差异位点数最多，而其它三个群体的植株差异位点数较少。ISSR技术检测的差异位点数比RAPD技术检测到的要高，但在四个群体中分布差异不明显。上述结果表明，通过对Ⅲ型愈伤组织选择性培养不会导致变异频率增加，魔芋组织培养中的不稳定性主要发生于基因组中重复区域，造成植株性状改变的可能性较小。 6．试管球茎是建立魔芋繁殖体系的适宜方式，魔芋试管球茎田间生长优势比试管苗明显。将魔芋试管球茎和试管苗进行田间种植，结果发现，试管球茎和试管苗均可用作种芋繁殖。但试管苗只在特定的苗龄期时成活率高，且受移栽时温度影响。试管球茎需要一段时间低温贮藏以完成生理休眠，其植株生长势强，成活率高，体积大的试管球茎(重量大于0.5g)优势更明显。与试管苗相比，由试管球茎产生的球茎体积大、重量高，更适宜于商品种芋的生产。