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魔芋离体形态发生机制及其繁殖技术

胡建斌  
【摘要】:魔芋(Konjac)是植物界中迄今发现唯一能大量合成葡苷聚糖(Konjac glucomannan)的高等植物,属天南星科(Araceae)魔芋属(Amrophophallus Blume),为多年生草本植物,广泛分布于我国西南山区,具有悠久的栽培和利用历史。魔芋葡甘聚糖是魔芋地下球茎主要贮藏物质,为一种高分子量碳水化合物,因具有良好的胶溶性、凝胶性、增稠性、成膜性及与其它植物胶的优良复配性等优点而在食品、化工、医药保健、环保等领域具有广泛的应用。因此,魔芋具有极高的市场开发和利用价值。 魔芋为单叶柄支撑的单叶植物,通常利用球茎着生的根状茎进行无性繁殖,其繁殖系数极低,且多年沿用无性繁殖造成病原菌的积累、种性的退化,进而导致魔芋产量下降、品质劣化。由于缺乏稳定的良种繁育体系,种芋的数量和质量已经成为魔芋生产发展的瓶颈。自上个世纪80年代以来,许多研究者试图利用组织培养技术生产脱毒试管苗,以繁殖种芋,但试管苗因移栽成活率低且对田间管理技术要求较高,不能实现周年供应和长距离运输等缺点,无法在实际生产中广泛运用。二十世纪90年代以来,随着对植物变态器官发育机理认识的不断深入,人们在试管中已成功诱导出了块茎、球茎、鳞茎等营养繁殖器官,其中马铃薯试管块茎生产体系最为成熟,已经实现了工厂化生产,但有关魔芋试管球茎的研究国内外尚未见报道。本研究以花魔芋(A.rivieri)和白魔芋(A.albus)为材料,对魔芋试管球茎的形成及魔芋组织培养繁殖方式开展了系列研究,主要结果如下: 1.幼嫩叶柄是魔芋组织培养较好的外植体,愈伤组织形成率高,状态好。MS+1.0mg/L NAA+1.0mg/L BA适宜于愈伤组织诱导,而MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L BA有利于愈伤组织增殖。愈伤组织在继代培养过程中可形成3种不同的类型,即Ⅰ:水渍状,半透明;Ⅱ:淡黄色,结构疏松;Ⅲ:浅红或绿色,呈瘤状或球状,结构致密。在分化培养基上,Ⅰ型愈伤组织不能分化出芽,Ⅱ型可分化出不定芽,而Ⅲ型可通过拟球茎再生完整植株。这三种类型愈伤组织在特定的培养条件下可相互转化。组织学观察显示,三种类型的愈伤组织其组成细胞类型明显不同,其中Ⅲ型愈伤组织由保守分裂型细胞组成,其细胞中含有淀粉和葡甘聚糖颗粒,是一种半组织化结构。中等浓度(1.0~2.0 mg/L)的细胞分裂素(BA、KT、ZT和TDZ)与低浓度(0.1~1.0mg/L)的NAA配合均能促使Ⅲ型愈伤组织再生植株。 2.魔芋离体形态建成以器官发生途径为主,拟球茎和芽发生是主要形式。组织学观察显示,魔芋叶柄无维管组织形成层,维管束外层薄壁在培养过程首先启动脱分化,进而形成愈伤组织。魔芋形态建成以器官发生途径为主,在特定培养条件下也可形成体细胞胚,但频率极低,且绝大部分体胚因高度畸形化而不能形成再生植株。魔芋可通过不定芽器官发生途径或拟球茎器官发生途径形成植株,通过拟球茎形成的植株不需生根培养就具有完整的根系,而不定芽在发育过程中不能直接生根且植株生长势弱。不定芽和拟球茎均起源于Ⅲ型愈伤组织的次表皮细胞,这类细胞在分化过程中首先形成拟分生组织团。拟分生组织团在分化培养中既可直接形成芽原基,进而发生不定芽,可形成一种中间的球状体,这种球状体具顶芽分生组织,叶原基不明显,它可进一步发育成拟球茎,进而形成完整植株。 3.内源GA_3含量增加伴随着不定芽发生,而JA含量增加伴随着拟球茎发生,内源激素平衡是器官发生方式的关键调空因素。魔芋叶柄薄壁细胞在脱分化形成愈伤组织过程中,其内源激素(IAA、GA_3、ABA和JA)含量发生了明显的变化。内源IAA含量培养初期缓慢下降,10d后快速上升,30d后达到平稳。内源ABA含量在培养20d内呈下降趋势,之后迅速上升。内源GA_3和JA含量则在整个愈伤组织诱导过程中迅速下降。研究发现,三种内源激素(GA_3、ABA和JA)在形成芽和拟球茎的愈伤组织中含量变化明显不同。内源GA_3水平在拟球茎发生过程中变动不大,而在不定芽发生过程中快速上升,其绝对含量也比前者高;内源ABA在拟球茎发生过程中基本维持稳定,而在不定芽发生过程中则迅速下降;内源JA含量在拟球茎形成过程中呈明显上升趋势,而在不定芽发生过程中变化不明显。只有内源IAA无论是拟球茎还是不定芽形成过程其含量均呈下降趋势。内源GA_3与ABA和JA的平衡水平在两种不同器官发生途径中呈现出明显的差异,但GA_3/JA差异最为显著,在两种器官发生途径中其变化趋势完全相反。上述结果说明,魔芋离体器官发生形式与内源激素变化及平衡水平相关。 4.魔芋试管球茎(即拟球茎)的形成受培养基和培养条件的影响。中等浓度的BA(1.0~2.0 mg/L)与低浓度的NAA(0.1~0.5 mg/L)配合有利于Ⅲ型愈伤组织形成试管球茎,其中以MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA表现最佳。在一定范围内提高培养基中蔗糖浓度有利于白魔芋试管球茎形成,其中6%(w/v)蔗糖效果最好。而花魔芋试管球茎形成所要求的蔗糖浓度较低(4%)。光周期对试管球茎的发生影响不明显,而培养温度的影响则较大,22℃条件下,花魔芋和白魔芋试管球茎形成率、形成个数和单球茎鲜重均达最大值。试管球茎在培养过程可产生次级小球茎以进行增殖,但自然增殖率较低,通过损伤主芽方法打破主芽顶端优势,可促使次级小球茎的发生。 5.选择性培养魔芋愈伤组织有助于降低再生植株遗传变异频率。对魔芋Ⅲ型愈伤组织进行选择并于适宜培养基上继代培养,弃除状态发生改变的愈伤组织类型,获得不同培养时期的4个再生植株群体G0(初代培养产生)、G2(继代3次产生)、G4(继代5次产生)和G7(继代8次产生)。经两种分子标记技术(RAPD和ISSR)分析显示,G0群体变异频率最高(RAPD:15.6%;ISSR:18.0%),G2、G4和G7的变异频率依次下降。四个群体中,G0再生植株的RAPD差异位点数最多,而其它三个群体的植株差异位点数较少。ISSR技术检测的差异位点数比RAPD技术检测到的要高,但在四个群体中分布差异不明显。上述结果表明,通过对Ⅲ型愈伤组织选择性培养不会导致变异频率增加,魔芋组织培养中的不稳定性主要发生于基因组中重复区域,造成植株性状改变的可能性较小。 6.试管球茎是建立魔芋繁殖体系的适宜方式,魔芋试管球茎田间生长优势比试管苗明显。将魔芋试管球茎和试管苗进行田间种植,结果发现,试管球茎和试管苗均可用作种芋繁殖。但试管苗只在特定的苗龄期时成活率高,且受移栽时温度影响。试管球茎需要一段时间低温贮藏以完成生理休眠,其植株生长势强,成活率高,体积大的试管球茎(重量大于0.5g)优势更明显。与试管苗相比,由试管球茎产生的球茎体积大、重量高,更适宜于商品种芋的生产。


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