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苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析

王莉  
【摘要】: 本论文以苏云金芽胞杆菌为研究对象,克隆并绘制了质粒pBMB165的物理图谱,同时对苏云金芽胞杆菌BMB171 Enhancin蛋白基因的增效活性做了初步研究。 本文第一部分,以苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis,H_(8ab))菌株YBT-1765为出发菌株,对其可检测到的最大质粒pBMB165进行克隆分析研究。通过对YBT-1765总质粒和全基因组DNA分别进行BamHI和HindⅢ不完全酶切,以pBeloBACll为载体,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组的细菌人工染色体(BAC)文库和质粒的BAC文库。根据已克隆的包含复制子oril65在内的3.6kb片段(pBMB165-F4A)中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针,通过染色体步移方式进行筛选。在对质粒文库进行筛选时,得到5个具有重叠关系的克隆子,测定这些克隆子的末端序列。根据这些末端序列设计引物,通过染色体步移方式,对YBT-1765的基因组BAC文库进行筛选,获得8个覆盖质粒pBMB165不同区域的克隆子。测定这8个阳性克隆子的末端序列,序列结果显示它们之间存在着重叠群,并且能够覆盖整个质粒pBMB165。通过对上述13个克隆子进行NotI、SphI、HindⅢ和BamHI酶切分析,建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图,并测算出该质粒的大小为82kb。对其中一个阳性克隆pBMB165A2作了序列测定;根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率,在pBMB165A2上转座因子存在的机率值为40.5%,说明pBMB165中存在丰富的转座因子,YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案,成功解决了大质粒难克隆的问题。 本文第二部分,以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为研究对象,对苏云金芽胞杆菌的Enhancin蛋白的增效活性做了初步研究,从而进一步认识Enhancin蛋白在促进Bt感染昆虫中的作用。根据已知的Enhancin蛋白基因序列设计特异引物,以BMB171菌株的基因组DNA为模板,能扩增出对应的预期目的片段Enhancin蛋白基因。经测序分析其预计蛋白质由742个氨基酸组成,其氨基酸序列与已经发现的昆虫病毒的增效蛋白有20%左右的序列一致,与鼠疫杆菌的增效蛋白同源性在31%以上。利用同源重组敲除BMB171菌株中的Enhancin蛋白基因,构建了突变株BMB1084。将表达杀虫晶体蛋白基因crylAc10的重组质粒pBMB1086导入菌株BMB171和突变株BMB1084,分别构建重组菌BMB1087和BMB1088。用上述重组菌的胞晶混合物分别感染棉铃虫一龄幼虫,重组菌BMB1087的LD_(50)为0.46 mL/mL,比BMB1088 (2.73mL/mL)降低了82.85%,增效倍数为5.83,表明Enhancin蛋白显著提高了Bt对棉铃虫幼虫的毒力。


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